体外哺乳类细胞基因突变（HGPRT）试验原理及注意事项-3
结果评价：
阳性结果的判定：
受试物组在任何一个剂量条件下的突变频率为阴性（溶媒）对照组的3倍或3倍以上，可判定为阳性。
受试物组的突变频率增加，与阴性（溶媒）对照组比较具有统计学意义，并有剂量-反应趋势，则可判定为阳性。
受试物组在任何一个剂量条件下引起具有统计学意义的增加并有可重复性，则可判定为阳性。
阴性结果的判定：
不符合上述阳性结果判定标准，则可判定为阴性。
【试验报告】
试验名称、试验单位名称和联系方式、报告编号。
试验委托单位名称和联系方式、样品受理日期。
试验开始和结束日期、试验项目负责人、试验单位技术负责人、签发日期。
试验摘要。
受试物：名称、鉴定资料、CAS编号（如已知）、纯度、与本试验有关的受试物的物理和化学性质及 稳定性等。
溶媒和载体：溶媒和载体的选择依据，受试物在溶媒和载体中的溶解性和稳定性。
细胞株：名称、来源、浓度及培养条件（包括培养基的组成、培养温度、CO2浓度和培养时间）。
试验条件：剂量、代谢活化系统、标准诱变剂、操作步骤等。
试验结果：各剂量组受试物（加和不加S9）对细胞的毒性和突变频率的均数和标准差、是否具有剂量-反应关系、统计结果，同时进行的阴性（溶媒）对照和阳性对照的均数和标准差、以及阴性（溶媒）对照和阳性对照的历史范围。
结论：本试验条件下受试物是否具有致突变作用。
【试验解释】
若阴性对照中，集落形成率或存活率低于50%，结果应不采用。各实验室选用的阳性对照突变频率有一定范围，若受试物的结果为阴性或弱阳性时，阳性对照的诱变率应达正常值的下限以上，否则结果不能成立。
HGPRT基因突变试剂盒
北京汇智泰康针对体外哺乳类细胞HGPRT基因突变试验开发HGPRT基因突变试剂盒，试剂盒提供了进行体外哺乳类细胞HGPRT基因突变试验所需的主要试剂和细胞(V79)，可用于评价受试物的致突变作用。所用细胞和试剂均符合国标GB
15193.12-2014 《食品安全国家标准 体外哺乳类细胞HGPRT基因突变试验》的要求。
20mL×24体系/盒，4个剂量组。
【产品使用说明】
1、细胞复苏
收到试剂盒后，请尽快复苏细胞。
从-70℃冰箱中取出细胞，于37℃水浴融化，离心，弃上清，用含10%胎牛血清（FBS）的RPMI-1640培养基重悬；再次离心，弃上清，用10% FBS培养基，接种于细胞培养瓶中，放置于37℃的二氧化碳培养箱中培养，后期细胞传代比例为1:3。
2、自发突变细胞清除
取对数生长期细胞悬液，于含1% （V/V）的THMG的培养液中培养24 h，离心，洗涤后将细胞接种于含1% （V/V）的THG（不含氨甲喋呤）培养液中继续培养1d~3d，至细胞恢复正常生长周期和形态。
注：为确保试验的可行性，试验中所用细胞的自发突变率应在5×10-6~20×10-6之间，清除自发突变的细胞传代使用不得超过1个月，且每次试验前需将细胞清除自发突变。
3、染毒处理
将5×105个细胞接种于直径为100mm的平皿中，于37℃，5%二氧化碳培养箱中放置培养24h。吸去培养液，PBS洗两次，加入一定量的无血清培养液、一定浓度的受试物及10%S9混合液（无需代谢活化者用无血清培养液或S9反应液PS补足），置于37℃，5%二氧化碳培养箱中培养3~6h，结束后吸去含受试物的培养液，用PBS洗细胞两次，换入含10%血清的培养液，继续培养19~22h，每个试验组平行处理两份培养物。
（1）S9混合液及染毒用细胞液配制
注：在试验过程中，需根据实际需求，调整配制量。
（2）推荐染毒培养体系配制方案（试剂盒仅提供1次完整实验的4个剂量组所需）
注：1.染毒时间可根据实际情况进行调整，一般为3h~6h，必要时可延长到1个或多个细胞周期。
2.如进行短时间染毒，可直接加入稀释并混合均匀的丝裂霉素C；若进行24h染毒，则需将丝裂霉素C再稀释2.5倍后再加入。
4、表达培养
接触受试物的细胞继续培养19~22h后，用胰酶-EDTA消化，待细胞脱落后，加入含10%血清的培养液终止消化，混匀，放入离心管中800r/min~1000r/min的速度离心5~7min，弃上清液，制成细胞悬液，计数，以5×105个接种于直径为100mm的平皿，3d后传代，仍接种5×105个细胞培养3d（最佳表达时间为6d~8d）。
5、细胞毒性测定
将上述首次消化计数后的细胞每皿接种200个，每组5个皿，37℃、5%的二氧化碳条件下培养7d，固定，Giemsa染色，计数每皿集落数。
以相对于溶媒对照组的集落形成率表示细胞毒性，即以溶媒对照的集落形成率为100%，求出各受试物组的相对值。计算公式见（1）：
A=B/C×100%------------------------------------------（1）
式中：A—相对集落形成率，%；B—受试物组集落形成率，%；C—溶媒对照组集落形成率，%。
6、突变体的选择和集落形成率的测定
表达培养结束后，消化细胞，分种，每组5个皿，每皿接种200个细胞，不加6-TG，7d后固定，Giemsa染色，统计每皿集落数，计算集落形成率。同时另做突变频率测定，每组5个皿，每皿接种2×105个细胞，待细胞贴壁后，按照千分之一的比例加入6-TG，放入培养箱中培养8~10d后固定，Giemsa染色，统计每皿集落数，计算突变频率。
集落形成率计算见式（2）：
D=E/F×100%-------------------------------------------（2）
式中：D—集落形成率，%；E—实际存活的细胞集落数；F—接种细胞数。
突变频率计算见式（3）：
式中：G—突变频率；H—突变集落数；I—接种细胞数；D—集落形成率。
7、结果评价
7.1 实验成立条件
若阴性对照中，集落形成率低于50%，结果应不予采用。
若受试物的结果为阴性或弱阳性时，阳性对照的诱变率应达正常值的下线以上，否则结果不成立。
7.2 结果判定
受试物组在任何一个剂量下的突变频率为阴性（溶媒）对照组的3倍或3倍以上，可判定为阳性。
受试物组的突变频率增加，与阴性（溶媒）对照组比较具有统计学意义，并有剂量-反应趋势，则可判定为阳性。
受试物组在任何一个剂量条件下引起具有统计学意义的增加并有可重复性，则可判定为阳性。
不符合上述阳性结果判定标准，则可判定为阴性。
【注意事项】
实验前请自行准备胎牛血清、RPMI1640基础培养液、胰酶-EDTA、Giemsa染色液、100mm平皿、灭菌枪头、无菌移液管、二氧化碳培养箱、振荡器、50mL离心管等，所有耗材需做无菌处理。
-
焦点事件
-
焦点事件
-
焦点事件
-
技术原理
