体外哺乳类细胞基因突变（HGPRT）试验原理及注意事项-1
In vitro Mammalian Cell Gene Mutation Test
【试验原理】
体外哺乳动物细胞基因突变试验是利用培养的哺乳动物细胞作指示生物的体外遗传毒理学试验，可用于检测有化学物质诱导的基因突变，适用的细胞系包括小鼠淋巴瘤细胞（L5178Y），中国仓鼠肺细胞（V79），中国仓鼠卵巢细胞（CHO），人类淋巴母细胞（TK6）等。这些细胞系，最常用的遗传学终点是检测胸苷激酶（TK）图标，次黄嘌呤鸟嘌呤转磷酸核糖激酶（HPRT/HGPRT）图标，黄嘌呤转磷酸核糖激酶（XPRT）基因突变。TK、HPRT/HGPRT、XPRT突变试验可以检测不同的遗传事件谱。
细胞在正常情况下，能产生HGPRT（次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶），在含有6-硫代鸟嘌呤（6-thioguanine,6-TG）的选择性培养液中，HGPRT催化产生核苷-5，-单磷酸（NMP），NMP掺入DNA中致细胞死亡。在致癌和（或）致突变物作用下，某些细胞X染色体上控制HGPRT的结构基因发生突变，不能再产生HGPRT，
从而使突变细胞对6-TG具有抗性作用，能够在含有6-TG的选择性培养液中存活生长。在有或无代谢活化系统的条件下，将细胞培养物暴露于受试物中适当时间，然后将细胞再传代培养，在含有6-TG的选择性培养液中，突变细胞会继续分裂并形成集落，计数突变集落形成数，计算突变频率，从而推断受试物的致突变性。
【参考标准】
GB 15193.12-2014 体外哺乳类细胞HGPRT基因突变试验
【材料和试剂】
细胞：常用中国仓鼠肺细胞株（V79）和中国仓鼠卵巢细胞株（CHO），其他如小鼠淋巴瘤细胞株（L5178Y）和人类淋巴母细胞株（TK6）亦可。细胞在使用前应进行有无支原体污染的检查。
培养液：应根据试验所用系统和细胞类型来选择适宜的培养基。对于 V79和 CHO
细胞，常用最低必需培养基（MEM，Eagle）、改良 Eagle培养基（DMEM）加人10%胎牛血清和适量抗菌素。对于 TK6 和
L5178Y细胞，常用 RPMI 1640培养液，加人10%马血清（培养瓶培养）或20%马血清（96孔板培养）和适量抗菌素（青霉素、链霉素）。
胰蛋白酶/EDTA溶液：用无钙、镁 PBS配制，胰酶的浓度为0.05 %，EDTA 的浓度为0.02% ,胰蛋白酶与EDTA溶液按1:1混合。-20℃储存。
活化系统：通常使用的是S9混合物。
选择剂：6-硫代鸟嘌呤(6-TG)，建议使用终浓度为5μg/mL～15μg/mL,用碳酸氢钠溶液(0.5 %)配制。
预处理培养液(THMG/THG)：为减少细胞的自发突变频率，在试验前，先将细胞加在含 THMG的培养液中培养24h，清除自发的突变细胞，然后再将细胞接种于THG(不含氨甲喋呤的THMG培养液)中培养1d～3d至细胞恢复正常生长周期和形态。
THMG 所含各物质终浓度如下(除培养液成分外):
————胸苷，5×10-6 mol/L；
————次黄嘌呤，5×10-5 mol/L；
————氨甲喋呤，4×10-7 mol/L；
————甘氨酸，1×10-4 mol/L；
【试验方法】
一、受试物
受试物配制：固体受试物应溶解或悬浮于适合的溶媒中，并稀释至适当浓度。液体受试物可直接使用或稀释至适当浓度。受试物应在使用前现用现配，否则就必须证实贮存不影响其稳定性。
溶媒的选择：溶媒必须是非致突变物，不与受试物发生化学反应，不影响细胞存活和S9活性。首选溶媒是蒸馏水；对于不溶于水的受试物可选择其他溶媒，首选二甲基亚矾(DMSO)，但使用时浓度不应大于0.5%。
对照：
每一项试验中，在有无代谢活化系统条件下均应设阳性和阴性(溶媒)对照组。
阳性对照：当使用代谢活化系统时,阳性对照物必须是要求代谢活化、并能引起突变的物质，可以使用3-甲基胆蒽(3-methylcholanthrene)、N-亚硝基二甲胺(N-nitroso-dimethylamine)、7,12-二甲基苯并[a]蒽(7, 12-dimethylbenz[a]anthracene)等。在没有代谢活化系统时,阳性对照物可使用甲磺酸乙酯(ethyl methanesulphonate)、乙基亚硝基脲(ethylnitrosourea)等。也可使用其他适宜的阳性对照物。
阴性对照：阴性对照(包括溶媒对照)除不含受试物外，其他处理应与受试物相同。此外，当不具有实验室历史资料证实所用溶媒无致突变作用和无其他有害作用时，还应设空白对照。
二、剂量
最高浓度选择：决定最高浓度的因素是细胞毒性、受试物在试验系统中的溶解度以及pH 或渗透压的改变。
细胞毒性确定：应使用指示细胞完整性和生长情况的指标，在代谢活化系统存在和不存在两种条件下确定细胞毒性，例如相对集落形成率或相对存活率。应在预试验中确定细胞毒性和溶解度。
浓度设置和最高浓度选择：至少应设置4个可供分析的浓度。当有细胞毒性时，其浓度范围应包括从最大毒性至几乎无毒性，通常浓度间隔系数在2～√10之间；如最高浓度是基于细胞毒性，那么该浓度组的细胞相对集落形成率或相对存活率应为
10%～20 %(不低于10%
)。对于那些细胞毒性很低的化合物，最高浓度应是5μL/mL、5mg/mL或0.01mol/L。对于相对不溶解的物质，其最高浓度应达到或超过在细胞培养状态下的溶解度限值；最好在试验处理开始和结束时均评价溶解度，因为由于S9等的存在，试验系统内在暴露过程中溶解度可能发生变化，不溶解性可用肉眼鉴别，但沉淀不应影响观察。
