体外哺乳类细胞基因突变（HGPRT）试验原理及注意事项-2
三、试验步骤和观察指标
贴壁生长细胞的试验步骤和观察指标：
1、细胞准备：将5×105 个细胞接种于直径为10 mm平皿中，于37℃、5%二氧化碳培养箱中培养24h。
2、接触受试物：吸去培养液，PBS洗两次，加人一定量的无血清培养液、一定浓度的受试物及S9混合物(无需代谢活化者用无血清培养液补足），置于培养箱中3h～6h，结束后吸去含受试物的培养液，用 PBS洗细胞两次，换入含10%血清的培养液，继续培养19h～22 h。
3、表达：接触受试物的细胞继续培养19h～22 h后用胰酶-EDTA 消化，待细胞脱落后，加入含10%血清的培养液终止消化，混匀，放入离心管以800r/min～1000r/min的速度离心5min～7min，弃上清液，制成细胞悬液，计数，以5×105 个细胞接种于直径为10 mm 的平皿，3d后传代，仍接种5×105个细胞培养3d（最佳表达时间为6d～8d）。
4、细胞毒性测定：将上述首次消化计数后的细胞每皿接种200个，每组5个皿，37℃、5二氧化碳条件下培养7d，固定，Giemsa染色，计数每皿集落数。
5、突变体的选择及集落形成率的测定：表达结束后，消化细胞，分种，每组5个皿，每皿接种200个细胞，不加6-TG，7d后固定，Giemsa染色，统计每皿集落数，计算集落形成率。同时另做突变频率测定，每组5个皿，每皿接种2×105个细胞，待细胞贴壁后加人6-TG（建议使用终浓度为5μg/mL～10μg/mL），放人培养箱培养8d～10d后固定，Giemsa染色，统计每皿集落数，并计算突变频率。
悬浮生长细胞的试验步骤和观察指标：
1、细胞准备及接触受试物：取生长良好的细胞，调整密度为5×105/mL，按1%体积加入一定浓度的受试物及S9混合物（无需代谢活化者用无血清培养液补足），37
℃振摇处理3h～6h，以800r/min～1000r/min的速度离心4min～6min，弃上清液，用PBS或无血清培养液洗细胞2次，重新悬浮细胞于含10%马血清的RPMI1640培养液中，并调整细胞密度为2×105/mL。
2、PE0（0天的平板接种效率）测定：取适量细胞悬液，作梯度稀释至8个细胞/mL，接种96孔板（每孔加0.2mL，即平均1.6个细胞/孔），每个剂量接种1～2块平板，37℃，5 二氧化碳，饱和湿度条件下培养9d～11d，计数每块平板有集落生长的孔数。
3、表达：取上一步所得细胞悬液，作6d表达培养，每天计数细胞密度并保持密度在1×106/mL以下。
4、PE6（第六天的平板接种效率）测定：表达培养结束后，取适量细胞悬液，按PE0（0天的平板接种效率）测定方法测定PE6。
5、突变频率（MF）测定：表达培养结束后，取适量细胞悬液，调整细胞密度为1×105/mL，加人6-TG（建议使用终浓度为5μg/mL～15μg/mL），混匀，接种96孔板（每孔加0.2mL，即2×104 个细胞/孔），每个剂量接种2～4块平板，37℃，5%二氧化碳，饱和湿度条件下培养11d～14d，计数有突变集落生长的孔数。
【数据处理和结果评价】
数据处理
贴壁生长细胞 HGPRT试验数据处理：
细胞毒性：以相对于溶媒对照组的集落形成率表示细胞毒性。即以溶媒对照的集落形成率为100%(1.00),求出各受试物组的相对值。
集落形成率和突变频率：
悬浮生长细胞 HGPRT试验数据处理：
平板接种效率(PE0、PE6)：
相对存活率（RS）：
突变频率（MF）：
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焦点事件
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焦点事件
