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肿瘤动物模型建立实验

2020.8.31

一、肿瘤动物模型建立的意义：（1）评价抗肿瘤免疫治疗的疗效；（2）作为抗肿瘤药物筛选模型；（3）为肿瘤转移研究提供更好的研究平台；（4）为研发抗肿瘤转移性药物提供良好的实验工具。二、诱发性肿瘤动物模型实验方法原理:诱发性肿瘤动物模型是指研究者用化学致癌剂、放射线、致癌病毒诱发动物的肿瘤等。实验材料：肿瘤细胞、小鼠性试剂、试剂盒：无血清培养基质、3%中性甲醇、石蜡仪器、耗材：低温离心机、血球计数器、游标卡尺实验步骤： 1、肝癌（1）二乙基亚硝胺（DEN）诱发大白鼠肝癌 ① 取体重250 g左右的封闭群大白鼠，雌雄不拘； ② 按性别分笼饲养。除给普通食物外，饲以致癌物，即用 0.25%DEN水溶液灌胃，剂量为10 mg/kg，每周一次，其余5天用0.025%DEN水溶液放入水瓶中，任其自由饮用； ③ 共约4个月可诱发成肝癌； ④ 也可以单用0.005%掺入饮水中口吸服8个月诱发肝癌。（2）4-2甲基氨基氮苯（DBA）诱发大鼠肝癌 ① 用含0.06%DBA的饲料喂养大鼠，饲料中维生素B2 不应超过1.5～2 mg/kg； ② 4～6月就有大量的肝癌诱发成功。（3）2-乙酰氨基酸（2AAF）诱发小鼠、狗、猫、鸡、兔肝癌 ① 给成年大鼠含0.03% 2AAF标准饲料； ② 每日每平均2～3 mg 2AAF（也可将2AAF混于油中灌喂），3～4月后有80～90%动物产生肝肿瘤。（4）二乙基亚硝胺诱发大鼠肝癌 ① 用剂量为每日0.3～14 mg/kg体重，混于饲料或饮水中给予； ② 6～9个月后255/300大鼠发生了肝癌。（5）亚胺基偶氮甲苯（OAAT）诱发小鼠肝癌 ① 用1%OAAF苯溶液（约0.1 ml含1 mg）涂在动物的两肩胛间皮肤上，隔日一次，每次2～3滴，一般涂100次。 ② 实验后7～8周即而出现第一个肝肿瘤，7个月以上可诱发小鼠肝肿瘤约55%。 ③ 或用2.5 mg OAAT溶于葵瓜子油中，给C3H小鼠皮下注射4次，每日间隔10天，也可诱发成肝癌。（6）黄曲霉素诱发大鼠肝癌每日饲料中含0.001～0.015 ppm，混入饲料中喂6个月后，肝癌诱发率达80％。 2、胃癌（1）甲基胆蒽诱发小鼠胃癌 ① 取20 g左右的小鼠，无菌手术下，在腺胃粘膜面穿挂含甲基胆蒽（MC）线结。 ② 含MC的线结是用普通细线，在一端打结后，将线结置于盛有MC小玻璃试管内，在酒精灯上微微加温，使MC液化渗入线结。MC浓度为0.05～0.1 g 20-甲基胆蒽内浸入10～20根线。 ③ 手术埋线后4～8个月可诱发成功胃癌。（2）不对称亚硝胺诱发小鼠胃癌剂量为0.25 ml/kg体重，3个月后全部动物发生前胃乳头状癌，7～8个月后有85～100%发生前胃癌。昆明种最敏感。A系次之，615系小鼠敏感性最差。（3）甲基亚硝基醋酸尿素诱发小鼠胃癌给BD大鼠饮水中加甲基亚硝基醋酸尿素，剂量为2 mg/kg体重，每周饮用5次，520天后全部大鼠均发生了腺胃癌。 3、食管癌（1）甲基苄基亚硝胺（MBNA）诱发大鼠食管癌 ① 取体重100 g以上的Wistar大鼠； ② 任其食用含甲基苄基亚硝胺的饮水，并将MBNA掺入饲料中使每日摄入量达0.75～1.5 mg/kg体重； ③ 80～100天可诱发成食管癌。（2）二烃黄樟素（Dihydrosafrole）诱发大鼠食管癌二烃黄樟素是一种制备啤酒的调味品，在大鼠饲料中加入百万分之二千五百至一万（2500～10000 ppm）黄樟素，就能引起20～75%的食管癌。（3）甲基苄基亚硝胺诱发大鼠食管癌 ① 用0.2%或0.005% 的甲基苄基亚硝胺水溶液，给动物经口灌喂，每天一次，大鼠灌注剂量为1 mg/kg体重； ② 至第27天即发现一例食管乳头状瘤，154天发现第一例食管癌， 11个月食管癌的发生率为53%。 4、肺癌（1）二乙基亚硝胺（DEN）诱发小鼠肺癌 ① 小白鼠每周皮下注射1%DEN水溶液一次，每次剂量56 mg/kg，DEN总剂量达到868 mg； ② 观察时间为100天左右时，发癌率可达40%。 ③ DEN总剂量达到1176 mg，观察时间为半年左右时；发癌率可达94%。（2）乌拉坦诱发肺腺癌 ① 小鼠（A系， 1～11/2月龄）较大鼠敏感，每次每只腹腔注入10%乌拉坦生理盐水液0.1～0.3 ml，间隔3～5日再注，共注2～3个月，每只小鼠用量约为 100 mg； ② 注后3个月肺腺癌发生率为100%，而且多数为多发性，这种诱发瘤为良性。（3）苯并芘诱发肺腺癌 ① 猴气管内注入3，4-苯并芘（苯并花为3～15 mg与等量之Fe2O3混合液），每周一次，共10次； ② 6只猴中有2只诱发肺的鳞状上皮癌。（4）硫酸铵气溶胶诱发肺腺癌 ① 用硫酸胺气溶剂给100只大鼠吸入； ② 13个月后所有大鼠都发生了肺腺癌。（5）甲基胆蒽诱发肺腺癌 ① 用0.2%明胶作悬浮剂将甲基胆蒽混合后给金地鼠气管内注入，每次0.1 ml（含甲基胆蒽 5 mg）每周一次，共6次； ② 53周后有62.5%动物发生了肺癌。 5、鼻咽癌（1）二甲基胆蒽（MC）诱发大鼠鼻咽癌 ① 取直径2～3 mm的硬质塑米管，在酒精灯上小火拉成锥形，每段长约3.5 cm，管内填以结晶体MC。 ② 小管一端用火封闭，以防药物外溢，尖端用针刺数孔，使MC能从小妃溢出。 ③ 取体重120 g左右的大白鼠，雌雄均可，乙醚麻醉后，由前鼻孔将上述含MC的塑料小管插入鼻腔，利用前鼻孔较小管粗端为小的特点，稍加用力，迫使小管全部进入鼻腔内，其尖部可达鼻咽腔。不需另加固定，即可使小管长期留于鼻腔内。 ④ 待到预定时间（半年以上），或动物自行死亡时，到其鼻咽部，10%福尔马林固定，脱钙后，石蜡包埋，进行连续切片。发癌率可达60%以上。（2）二乙基亚硝胺滴鼻法诱发鼻咽癌 ① 取120 g左右大白鼠，雌雄均可，乙醚麻醉后，用磨平针尖的8号针头，从前鼻孔轻轻插入，针尖可达鼻咽腔； ② 经注射器灌注用1%吐温-80新配的 33.3%DEN混悬液0.0 2 ml(含DEN 6.7 mg)每周1次，共15～20次，可诱发成鼻咽癌。 6、宫颈癌二甲基胆蒽（MC）诱发宫颈取雌性小白鼠，以附有0.1 mgMC的棉纱线结在动物不麻醉的状态下，借助于阴道扩张器及磨纯的弯针，将线穿入宫颈。经右宫角背部穿出，使线结固定于宫颈口。线的另一端则固定于背部肌肉，缝合皮肤，挂线以后，同日开始连续注射青霉素2～3天。以防术后感染。至一定时间（半年左右）处死动物，宫颈组织用10%福尔马林固定，石蜡包埋，连续切片。 7、结肠癌二甲基苄肼（Dimethlhydrazine，DMH）诱发鼻咽癌 ① 给四周龄的雄性大白鼠，皮下注射二甲基苄肼（Dimethlhydrazine，DMH）每周一次，连续21周，每次 DMH21 mg/kg； ② 最后一次给药后1～4周，处死动物； ③ 降结肠部位用Bouin液固定，脱水，石蜡包埋，切片。所用之DMH先配成每100 ml含 400 mg的母液，并加EDTA37 mg，用氢氧化纳（0.1 N）液将pH调至6.5备用。注意事项： 1、要设计不同的实验组和对照组，每组动物数一般为 5-10 只； 2、一般接种肿瘤6-8 周后，小鼠的肿瘤可生长至直径为 15-20mm ( 即小鼠会濒临死亡) 时，可眼球取血，分离血清并保存血清，处死小鼠，取肿瘤组织照相，取部分肿瘤组织作冰冻组织切片( 或- 80℃ 保存)，作相应的免疫组织化学染色，取部分肿瘤组织用3%中性的甲醛固定，石腊包埋，作常规HE 染色。其他： 1、芳香胺及偶氮染料类致癌物的特点（1）通常需要长期、大量给药才能致癌；（2）肿瘤多发生于远隔作用部位的器官如膀胱、肝等；（3）有明显的种属差异；（4）其本身不是直接致癌物，致癌是由于其某种代谢产物的作用；（5）其致癌作用往往受营养或激素的影响，例如，奶黄仅在以缺少蛋白质和核黄素的饲料喂饲大鼠时才引起肝癌，而且雄性大鼠较敏感，邻位氨基偶氮甲苯则易起雌性大鼠的肝癌。 2、亚硝胺类的致癌特点（1）致癌性强，小剂量一次给药即可致癌；（2）对多种动物（包括猴、豚鼠等不易诱发肿瘤的动物）的许多器官（包括食管、脑、鼻窦等不易引起癌的器官）能致癌，甚至可以通过胎盘致癌，如给怀孕大鼠以二乙基亚硝胺（Diethy lnitrosamine,DEN）可比较快地引起仔鼠的神经胶质细胞瘤；（3）具有不同结构的亚硝胺有明显的器官亲和性，例如二甲基亚硝胺等对称的衍生物常引起肝癌，不对称的亚硝胺如甲基苄基亚硝胺常诱发食管癌；在大鼠，二丁基亚硝胺能引起膀胱癌，二戊基亚硝胺能诱发肺癌，而N-甲基-N-硝基-N-1-亚硝基胍则能引起胃肠癌。 3、黄曲霉毒素的致癌特点（1）黄曲霉毒素的毒性很强，很小剂量（1mg/kg体重）即可使狗、幼龄大鼠、火鸡或小鸭致死；（2）其致癌性也极强，最小致癌剂量比亚硝胺还要小数十倍，是已知化学致癌物中作用最强者；（3）它能诱发多种动物（从鱼到猴）的肝癌，也可引起肾、胃及结肠的腺癌，滴入气管内可引起肺鳞状细胞癌；（4）注入皮下可引起局部的肉瘤，还有报告认为，它可引起泪腺、乳腺、卵巢等其它部位的肿瘤。 4、其他在动物实验中早已确定：乙硫氨酸可诱发大鼠肝癌；乌拉坦（氨基甲酸乙酯，C２H５O－CONH２）、氨乙胺可引起小鼠的肺癌；一些卤代烃如四氯化碳、氯仿等可引起大鼠或小鼠的肝癌。三、自发型肿瘤动物模型实验方法原理：自发性肿瘤动物模型是指未经人为处理；自然发生的肿瘤动物模型，主要有自发性乳腺癌模型和自发性白血病模型。实验材料：C3H小、鼠、A系小鼠、CGA小鼠试剂、试剂盒：受试药仪器、耗材：记号笔、脚规实验步骤： 1、自发性乳腺癌小鼠模型类型 ① C3H小鼠：繁殖用雌鼠自发性乳腺癌发生率为85%~100% ② A系小鼠：经产雌鼠乳腺肿瘤发生率为30%~80% ③ CBA小鼠：雌鼠自发性乳腺癌发生率为60%~65% 2、在乳腺左右两侧及乳头部均可发生肿瘤。每只小鼠常见1个以上肿瘤。选择肿瘤数目和大小相近的动物，配对分组，给予受试药，观察受试药对肿瘤发展的影响。 3、给药方案和给药途径可根据受试药物的特点确定。因自发性乳腺癌发展较缓慢，故采用间歇给药或小剂量连续给药较为合适。 4、结果判定 ① 给药后每天观察肿瘤生长情况，记录发生时间和位置； ② 肿瘤结节长到一定程度，每周用脚规测量皮下肿瘤2次。测定肿块的最大径(a)和最小径(b)。肿瘤体积(cm3) = ab2/2； ③ 将肿瘤体积变化对时间作出生长曲线,可由曲线的斜率变化判断药物抑制肿瘤生长的作用,尤其应观察肿瘤能否完全消退。 5、AKR白血病模型 AKR小鼠为白血病高发品系，淋巴细胞白血病发病率雄性76%~90%，雌性为68%~90%。 6、实验用6~12月龄AKR小鼠，此时鼠的脾和淋巴结肿大，血象异常。 7、经血液检查确诊为白血病后的次日，配对分组并开始给予受试药，观察结果。 8、结果判定观察指标：末梢血象,白细胞数,淋巴结和脾大小,动物生存时间。有效者生存期比对照组延长，并根据血象评价药物的诱导缓解和维持缓解作用。注意事项： ① 在同一品系内,发病率比较稳定,而不同品系间差别甚大。 ② 动物乳腺癌发生与遗传基因、乳癌因子(即致乳癌病毒)及激素有关。 ③ 饲料的变更有明显影响,要用固定全价营养饲料。 ④ 配对分组。 ⑤ 各鼠白血病的病程不一,自发瘤确诊后, 实验时应配对分组。小编寄语关于肿瘤动物实验，南京欧际拥有一套完善的技术服务管理体系药物筛选及药理学评价服务一、抗肿瘤药物筛选服务及药理学评价 1.抗肿瘤药物体外筛选服务（可提供200多种细胞株）服务目录号实验名称实验内容服务周期提交结果样品需要量参考价格 ECROA001 药物体外筛选细胞增殖检测（MTT法）肿瘤细胞株药物IC50检测 2周实验报告 1-2 mg;混合物5 -10mg 600元/样品/一个细胞株 ECROA002 耐药细胞株药物IC50检测 2周实验报告 1-2 mg;混合物5 -10mg 800元/样品/一个细胞株 ECROA003 正常细胞株药物IC50检测 2周实验报告 1-2 mg;混合物5 -10mg 600元/样品/一个细胞株 ECROA003 肿瘤细胞株药物单一浓度初筛 1周实验报告 1-2 mg;混合物5 -10mg 200元/样品/一个细胞株 ECROA004 耐药细胞株药物单一浓度初筛 1周实验报告 1-2 mg;混合物5 -10mg 300元/样品/一个细胞株 ECROA005 正常细胞株药物单一浓度初筛 1周实验报告 1-2 mg;混合物5 -10mg 200元/样品/一个细胞株 ECROA006 药物体外筛选细胞增殖检测（CCK-8法）肿瘤细胞株药物IC50检测 2周实验报告 1-2 mg;混合物5 -10mg 650元/样品/一个细胞株 ECROA007 耐药细胞株药物IC50检测 2周实验报告 1-2 mg;混合物5 -10mg 850元/样品/一个细胞株 ECROA008 正常细胞株药物IC50检测 2周实验报告 1-2 mg;混合物5 -10mg 650元/样品/一个细胞株 ECROA009 肿瘤细胞株药物单一浓度初筛 1周实验报告 1-2 mg;混合物5 -10mg 250元/样品/一个细胞株 ECROA010 耐药细胞株药物单一浓度初筛 1周实验报告 1-2 mg;混合物5 -10mg 350元/样品/一个细胞株 ECROA011 正常细胞株药物单一浓度初筛 1周实验报告 1-2 mg;混合物5 -10mg 250元/样品/一个细胞株 2.抗肿瘤药物裸鼠体内筛选服务 2.1.人体肿瘤裸鼠异种移植模型模型编号模型名称英文名称服务周期提交结果样品需要量参考价格 ECROM001 人肝癌裸鼠异种移植模型 HepG-2 六周研究报告＞100mg 询价 ECROM002 人肝癌裸鼠异种移植模型 QGY-7701 六周研究报告＞100mg 询价 ECROM003 人肝癌裸鼠异种移植模型 SMMC-7721 六周研究报告＞100mg 询价 ECROM004 人肝癌裸鼠异种移植模型 Bel7402 六周研究报告＞100mg 询价 ECROM005 人胃癌裸鼠异种移植模型 SGC-7901 六周研究报告＞100mg 询价 ECROM006 人胃癌裸鼠异种移植模型 MGC-803 六周研究报告＞100mg 询价 ECROM007 人胃癌裸鼠异种移植模型 BGC-823 六周研究报告＞100mg 询价 ECROM008 人胃癌裸鼠异种移植模型 MKN-45 六周研究报告＞100mg 询价 ECROM009 人胃癌裸鼠异种移植模型 HGC-27 六周研究报告＞100mg 询价 ECROM010 人肠癌裸鼠异种移植模型 HCT-116 六周研究报告＞100mg 询价 ECROM011 人肠癌裸鼠异种移植模型 SW116 六周研究报告＞100mg 询价 ECROM012 人肠癌裸鼠异种移植模型 LS-174-T 六周研究报告＞100mg 询价 ECROM013 人肠癌裸鼠异种移植模型 CL187 六周研究报告＞100mg 询价 ECROM014 人原位胰腺腺癌裸鼠异种移植模型 BxPC-3 六周研究报告＞100mg 询价 ECROM015 人食管癌裸鼠异种移植模型 ECA-109 六周研究报告＞100mg 询价 ECROM016 人肺癌裸鼠异种移植模型 NCI-H460 六周研究报告＞100mg 询价 ECROM017 人肺癌裸鼠异种移植模型 A549 六周研究报告＞100mg 询价 ECROM018 人乳腺癌裸鼠异种移植模型 BCaP-37 六周研究报告＞100mg 询价 ECROM019 人乳腺癌裸鼠异种移植模型 MX-1 六周研究报告＞100mg 询价 ECROM020 人乳腺癌裸鼠异种移植模型 MDA-MB-231 六周研究报告＞100mg 询价 ECROM021 人卵巢癌裸鼠异种移植模型 A2780 六周研究报告＞100mg 询价 ECROM022 人宫颈癌裸鼠异种移植模型 SiHa 六周研究报告＞100mg 询价 ECROM023 人宫颈癌裸鼠异种移植模型 HeLa 六周研究报告＞100mg 询价 ECROM024 人膀胱癌裸鼠异种移植模型 EJ 六周研究报告＞100mg 询价 ECROM025 人膀胱癌裸鼠异种移植模型 T24 六周研究报告＞100mg 询价 ECROM026 人肾癌裸鼠异种移植模型 Ketr-3 六周研究报告＞100mg 询价 ECROM027 人前列腺癌裸鼠异种移植模型 PC-3M 六周研究报告＞100mg 询价 ECROM028 人前列腺癌裸鼠异种移植模型 22RV1 六周研究报告＞100mg 询价 ECROM029 人前列腺癌裸鼠异种移植模型 C4-2 六周研究报告＞100mg 询价 ECROM030 人鼻咽癌裸鼠异种移植模型 CNE-2Z 六周研究报告＞100mg 询价 ECROM031 涎腺腺样囊性癌裸鼠异种移植模型 ACC-2 六周研究报告＞100mg 询价 ECROM032 人喉表皮癌裸鼠异种移植模型 HeP2 六周研究报告＞100mg 询价 ECROM033 人舌鳞癌裸鼠异种移植模型 Tca-8113 六周研究报告＞100mg 询价 ECROM034 人黑色素瘤裸鼠异种移植模型 A375 六周研究报告＞100mg 询价 ECROM035 人黑色素瘤裸鼠异种移植模型 M14 六周研究报告＞100mg 询价 ECROM036 人黑色素瘤裸鼠异种移植模型 MV3 六周研究报告＞100mg 询价 ECROM037 人白血病裸鼠异种移植模型 HL60 六周研究报告＞100mg 询价 2.2.人体肿瘤裸鼠原位移植模型模型编号模型名称移植部位英文名称服务周期提交结果样品需要量参考价格 ECROM038 人乳腺癌裸鼠原位移植瘤乳腺 MDA-MB-231 六周研究报告＞100mg 询价 ECROM039 人肝癌原位移植肿瘤肝脏 HepG2 六周研究报告＞100mg 询价 ECROM040 人前列腺癌细胞泪腺 PC3 六周研究报告＞100mg 询价 ECROM041 人前列腺癌细胞泪腺 DU145 六周研究报告＞100mg 询价 2.3.小鼠肿瘤模型模型编号模型名称英文名称服务周期提交结果样品需要量参考价格 ECROM042 小鼠肝癌模型 H22 六周研究报告＞100mg 询价 ECROM043 小鼠结肠癌 CT26 六周研究报告＞100mg 询价 ECROM044 小鼠前列腺癌 RM-1 六周研究报告＞100mg 询价 ECROM045 小鼠宫颈癌模型 U14 六周研究报告＞100mg 询价 ECROM046 小鼠肺癌模型 Lewis 六周研究报告＞100mg 询价 ECROM047 小鼠乳腺癌模型 4T1 六周研究报告＞100mg 询价 ECROM048 小鼠肉瘤模型 S180 六周研究报告＞100mg 询价 ECROM049 小鼠艾氏腹水模型 EAC 六周研究报告＞100mg 询价 ECROM050 小鼠黑色素瘤模型 B16BL6 六周研究报告＞100mg 询价 ECROM051 小鼠黑色素瘤模型 B16F10 六周研究报告＞100mg 询价 ECROM052 小鼠黑色素瘤模型 B16F1 六周研究报告＞100mg 询价 3.动物转移模型模型编号模型名称英文名称服务周期提交结果样品需要量参考价格 ECROM053 DBA/2小鼠淋巴道转移 P388D1 六周研究报告＞100mg 询价 ECROM054 C57BL/6小鼠黑色素瘤肺转移模型 B16F10 六周研究报告＞100mg 询价 ECROM055 C57BL/6小鼠黑色素瘤肺转移模型 B16BL6 六周研究报告＞100mg 询价 4.抗血管生成药物体外筛选服务服务目录号实验名称服务周期提交结果样品需要量参考价格 ECROA034 内皮细胞增殖实验二周研究报告 1-2mg 600元/样品 ECROA035 内皮细胞凋亡实验二周研究报告 1-2mg 600元/样品 ECROA036 基质金属蛋白酶（MMPs）抑制剂筛选三周研究报告 1-2mg 询价 ECROA037 划痕实验（二维；单层内皮细胞伤口法）四周研究报告 1-2mg 询价 ECROA038 博伊登小室实验（二维；内皮细胞迁移实验）四周研究报告 1-2mg 询价 ECROA039 胶原侵袭实验（三维；内皮细胞迁移侵袭实验）四周研究报告 1-2mg 询价 ECROA040 基质胶实验（二维，内皮细胞成血管能力实验）四周研究报告 1-2mg 询价 ECROA041 Beads血管生成实验（三维，内皮细胞成血管能力实验）四周研究报告 1-2mg 询价 ECROA042 大鼠胸主动脉环血管生成实验（三维，血管原位新生血管能力检测）四周研究报告 1-2mg 询价 5.抗血管生成药物体内活性筛选服务服务目录号实验名称服务周期提交结果样品需要量参考价格 ECROA043 鸡胚脲囊膜血管生成实验四周研究报告 5-10mg 询价 ECROA044 家兔眼角膜血管生成实验四周研究报告 5-10mg 询价 ECROA045 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