1. 将组织移人新鲜、无菌的 DBSS 中，淸洗。
2. 转入另一培养皿（9 cm 皮氏平皿，非组织培养级別），切除多余组织，如脂肪或坏死组织。
3. 将组织转移至第三个平皿中，用交叉的手术刀细切成大约 1 mm3 大小。
4. 用 10~20 ml 广口移液管将组织移入 15 ml 或 25 ml 无菌离心管或常用的容器， 中（先用 DBSS 湿润移液管，否则组织块易贴壁）。
5. 让组织块沉降。
6. 用 DBSS 重悬清洗组织，组织块沉降后，去除上清液，重复此步骤两次以上。
7. 将 20~30 个组织块接种于一个 25 cm2 的培养瓶中，另一瓶中接种 100~200 块。
8. 吸净 DBSS，每瓶中加入 4.5 ml 含血清的培养基（如 DMEM/F12加10 % 胎牛血清）。
9. 加入 0.5 ml 粗制胶原酶（2000 U/ml，Worthington CLS 或 Sigma 1A），终浓度为 200 U/ml。
10. 于 37°C 培养 4~48 h，无需振荡。肿瘤组织（如乳腺或结肠的硬癌）由于分解较慢，可作用 5 天或更长时间。有时由于时间过长 pH 过度下降（pH<6. 5），要将组织离心并用新的培养基和胶原酶重悬。
11. 轻轻晃动培养瓶检查分离情况：组织块呈点状分布于培养瓶底部，适当吸打后分散成单一细胞或小的组织块。
12. 有些组织（肺、肾、结肠或乳腺癌）的部分上皮细胞小团块对胶原酶耐受，沉淀 2 min 即可与其他剩余组织分离。若将其用 DBSS 重悬，沉淀后将沉淀物接种于培养基中，将形成生长旺盛的上皮细胞岛。上皮细胞往往在未完全解离时存活较好。
13. 完全分解或组织块沉降后，收集上清液中的细胞，于 50~100g 离心 3 min（离心管或常规容器，15~50 ml，依据处理组织的量而选择） 。
14. 去除 DBSS 或培养基上清液，重悬，加入 5 ml 培养基，接种于 25 cm2 培养瓶中。若胶原酶作用时 pH 下降了（pH< 6.5 达 48 h )，去除胶原酶后用 2 倍或 3 倍培养基稀释细胞悬液。
15. 于 48 h 后更换培养基。 展开 | 
