蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE,polyacrylamide gel ...3
【目的和要求】
1. 掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本原理
2. 掌握垂直板状凝胶电泳槽的使用和凝胶的配制方法。
3. 学会利用相对迁移率分析蛋白质种类。
【实验原理】
带电颗粒在电场的作用下，向着与其相反的电极移动，称为电泳。
电泳做为一种物质分离及鉴定技术，其原理在于任一物质质点，由于其本身的解离作用或由于表面上吸附有其它带电质点，在电场中便会向一定的电极移动。蛋白质是两性电解质，在一定的pH条件下，就会解离而带电，带电的性质和多少取决于蛋白质分子的性质和溶液的pH值和离子强度。处于pI的蛋白质分子所带的电荷为零，在电场中不移动。若pH＜pI，蛋白质分子带正电荷，在电场中向负极移动，pH＞pI的情况正好相反。
目前所采用的电泳方法大致可分为三类：显微电泳，自由界面电泳及区带电泳。以区带电泳应用比较广泛，区带电泳按其支持物的物理性状，可以分为四大类：（1）滤纸电泳及薄膜电泳（如醋酸纤维素薄膜电泳）；（2）粉末电泳：如纤维素粉、淀粉电泳等；（3）细丝电泳：如尼龙丝、人造丝电泳；（4）凝胶电泳：如聚丙烯酰胺和琼脂糖凝胶电泳。
聚丙烯酰胺凝胶，是由丙烯酰胺单体（Acr）和少量的交联剂N，Nˊ-甲叉双丙烯酰胺（Bis）在催化剂（过硫酸胺或核黄素）和加速剂（N，
N，NˊNˊ-四甲基乙二胺）的作用下聚合交联成的三维网状结构的凝胶。以此凝胶为支持物的电泳称聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）。具有机械性能好、化学性能稳定、灵敏度好、分辨率高的优点。PAGE应用十分广泛，可用于蛋白质、酶、核酸等生物分子的分离、定性、定量和少量制备，还可测定分子量和等电点等。
PAGE根据其有无浓缩效应，分为连续系统和不连续系统两大类。前者电泳体系中缓冲液pH及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场中的泳动主要靠电荷和分子筛效应；后者电泳体系中缓冲液离子成分、pH、凝胶浓度及电位梯度是不连续的，带电颗粒在电场中的泳动不仅主要靠电荷和分子筛效应，还有浓缩效应。
（1）凝胶对样品分子的筛选效应（分子筛效应）
电场中，颗粒小、呈球形的样品分子泳动速度快；颗粒大、形状不规则的分子通过凝胶空洞时受到的阻力大，泳动慢。
（2）不连续系统对样品的浓缩效应
凝胶层的不连续性：不连续系统的凝胶包括浓缩胶和分离胶。浓缩胶的孔径大，分离胶的孔径小。在电场的作用下，蛋白质颗粒在大孔胶中泳动时遇到的阻力小，移动快。而在小孔胶中泳动时遇到的阻力大，移动慢。因此，在两层凝胶的交界处，由于凝胶孔径的不连续性使样品迁移受阻而压缩成很窄的区带。
缓冲液离子成分和pH的不连续性：在两层凝胶中均有Tris和HCl。Tris的作用是维持溶液的电中性及pH。HCl在一定pH条件下易解离出Cl-
，它在电场中迁移率大，走在最前面，故称为快离子或前导离子。电极缓冲液中的甘氨酸在pH8.3的缓冲液中解离度很小，仅为0.1-1%，因而在电场中迁移率很小，称为慢离子或尾随离子。血清中，大多数蛋白质pI在5.0左右，在
pH8.3或6.7时均带负电荷，在电场中均移向正极，其有效迁移率介于快慢离子之间，于是蛋白质就在快慢离子间形成的界面处，被浓缩成极窄的区带。当进入pH8.9的分离胶时，甘氨酸解离度增加，其有效迁移率超过蛋白质，因此氯离子和甘氨酸离子沿着离子界面继续前进。蛋白质分子由于分子量大，被留在后面，然后分离成多个区带。
此外，电泳体系中电位梯度的不连续性对样品的浓缩和迁移也具有一定作用。
