转基因大鼠在突破技术限制再次发挥在特定领域研究...-2
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考虑到Cre大鼠需要与LoxP大鼠杂交一至两代才能得到条件性基因编辑动物，同时Cre酶也存在效率和一定概率的泄露问题，可能会对科研进度产生影响，病毒诱导的大鼠基因过表达/敲除/敲入/点突变便应运而生。
目前主要使用的病毒表达系统有三种，即腺病毒（Adeno）、慢病毒和腺相关病毒表达系统，这些病毒系统各有优缺点：
1）腺病毒的优点是表达效率高，表达起始时间早，可包装DNA片段相对最大，但有很强的免疫原性和毒性，一般适用于离体细胞转染，用在活体上的话动物死亡率高，实验窗口期短。
2）慢病毒则可以逆转录成DNA，并永久整合到宿主基因中，因此目的基因可以长期稳定表达，慢病毒是最常用的基因传递病毒系统，并且具有比腺病毒小得多的免疫原性。虽然也可以用作活体转染，但是在滴度，效率和免疫原性都更好的腺相关病毒面有些“相形见绌”。
3）腺相关病毒的最大优势在于极低的免疫原性可以在最大可能地保证自己能与宿主长期共存。生物安全性也很高，可以在生物安全等级较低的实验室中进行实验，种类繁多的血清型使得其对不同组织的亲和度有区别，使得即便在全身注射的情况下仍然具有很强的组织特异性，辅以定位注射的话，可以大大提高实验的组织细胞精度，是最适合活体实验的工具病毒，但也存在克隆容量不足的问题。
图1. 三种常见病毒载体比较
综合三种工具病毒的优缺点来看，在与Cre或者LoxP动物联用方面，AAV介导的组织特异性表达具有相对于另外两种病毒系统更好的效果。
图2.不同AAV的组织特异性
正因为AAV的这些优点，得以使其在与Cre或者LoxP大鼠鼠的配合中大放异彩。这是因为虽然人们正在开发更多的LoxP和Cre大鼠，但这个过程并非一蹴而就。考虑到大鼠中Cre酶的效率和有可能存在的泄露问题，可能导致开发时间会变得更长。因此，目前最佳策略是在开发Cre和LoxP大鼠的同时，利用AAV病毒先行对已有大鼠进行组织特异性操作。病毒载体的构建总是要比动物繁殖到可用于实验的数量所需时间要少得多。因此可以通过这种方法尽快对动物的表型进行研究和验证，尽早决定下一步的研究策略和方向，节省科研人员宝贵的时间。
需要注意的是，AAV注射所产生的特异性表达并非仅仅只是节省时间的“权宜之计”。由于生命科学研究中体内实验的不确定性，以及目前开发出来的越来越丰富的研究手段，要想研究结果得到认同，多种方法交叉验证也能为自己的论文质量增加砝码。
此外，Cre-LoxP动物虽然在对基因的空间特异性研究方面已经很成熟了，也存在转入的启动子在多个组织中同时表达的情况，而如果这时我们的焦点仅仅是一种组织，那么其他组织中Cre的表达仍然会对我们的研究精度产生干扰。AAV的定点注射恰好可以完美地解决这个问题，因为我们只需要在自己想要研究的组织中注射病毒就好，区域特异性很强。
为了进一步利用好手头的基因编辑鼠，AAV注射的方案也可以分为两种，一种是如果手头有LoxP的大鼠，可以注射AAV包装组织特异性的Cre；反过来，如果手头有Cre大鼠，则可以反过来注射包装了连端有LoxP位点的目的基因或者其他元件的病毒。不过一般而言，对组织特异性Cre进行AAV包装更为常见。
图3. AAV病毒包装DNA与大鼠联用进行条件性表达
虽然AAV介导的条件性基因编辑有着上面所提到的诸多优点，但凡是有利就必有其弊。AAV注射的弊端首先就在于其包装片段长度短，这就注定一些大片段的基因无法采用这种方法，使其适用范围受到局限，经常需要在报告基因等附件基因元件上做出取舍，Cre基因之前启动子的选择也比较受限制；另外一点就是有一定的学习成本，这个成本包括时间和资金花费，尤其是脑部注射，由于要精确到不同的脑区，而老鼠的脑子本来就不大，而且由于年龄，性别，品系，生长史等原因，每只动物都并不会完全长成图谱中的样子，所以要精确掌握给药位置是需要狠下一番功夫的；病毒由于是外源物，并非细胞本身产生，因此会出现注射部位的浓度分布不均，从而对实验结果造成影响，这很好理解，注射的中心部位的病毒含量肯定是要高于周边的。最后就是成本问题，虽然大多数情况下采用AAV进行条件性表达的成本是要低于Cre-LoxP小鼠的，但也有两种情况例外，首先就是如果我们采用的是全身性注射，病毒的消耗量也是很大的，而且随着注射病毒动物数量的增加，病毒的花费可以说是线性增长的；而采用杂交小鼠的方案则不同，虽然前期投入以及动物的饲养都是大量经费的燃烧，但是一旦品系构建成功，不出意外的话可以持续使用，后期的费用就是饲养普通动物的费用水平了，呈边际递减状态。
总而言之，只有充分考虑两种方法的利弊之后再进行决策才能将其运用自如，在条件允许的情况下，AAV辅助条件性敲除动物和传统的Cre-LoxP动物即有互补性，又能相互验证，在加上大鼠本身的优点，在代谢，心血管和神经等方面将具有无穷的潜力，为这些疾病提供更完善的模型，成为生物医药研究中不可或缺的助力。
参考文献：
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