定点诱变实验
基本方案
利用PCR引物点突变
| 实验材料 | DNA |
|---|---|
| 试剂、试剂盒 | TE 寡核苷酸引物 质粒 dNTP DNA聚合酶 氯仿 石蜡油 无水乙醇 |
| 仪器、耗材 | 离心管 热循环仪 离心机 |
| 实验步骤 |
1. 利用突变区两侧的限制性内切酶位点将待诱变的DNA片段亚克隆进高拷贝数的载体中。
2. 用小量制备的质粒提取模板DNA，用TE缓冲液重悬100 ng DNA至终浓为1 ng/μl。
3. 合成寡核苷酸引物，以变性聚丙烯酰胺凝胶电泳法进行纯化，重悬于500 μl TE缓冲液中，在A260吸光度，调整浓度至500 ng/μl。 4. 往两个500 μl 量离心管加入下列试剂，其中一管加寡核苷酸1，另一管加寡核苷酸2：
10 μl 10×扩增反应缓冲液
1 μl 寡核苷酸1或2
5. 按下列条件在自动热循环仪上扩增20~5个循环：
最后一个循环结束后，在72℃保温10min。
6. 取4 μl进行非变性琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳，以验证扩增反应已产生了预期的 产物。
7. 吸去石蜡油，并用氯仿抽提1次以去掉剩余的石蜡油，酚抽提和乙醇沉淀。
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