感受态细胞的制备
感受态细胞的制备
1.挑取适当菌株的E.coli 单菌落接种于2ml SOB培养液中,37℃摇床过夜。
2.取0.5-1ml过夜培养的菌液转种到50ml SOB中,18℃剧烈震荡,直到A600达到0.6。
3.将培养物转移到50ml离心管中,4℃ 4,000rpm/min离心10min。同时在冰浴上配置TB溶液。
4.弃上清,将离心管倒置于滤纸上,使培养液被吸干。
5.取1ml刚配的TB溶液打散菌体沉淀,再加入15ml TB(1/3体积的起始培养液),冰浴10-15min,4℃ 4,000rpm/min离心10min。
6.弃上清,沉淀重悬于4ml TB(1/12.5体积的起始培养液),冰浴10min。
7.加入280μl DMSO,缓缓滴入并轻轻摇晃,使其充分混合均匀,冰浴10min。
8.将菌液分装于EP管中,-80℃或液氮冻存。
9. 取两管感受态细胞分别加入1μl无菌ddH2O(阴性对照)和1μl纯质粒(阳性对照)进行转化(见后),以检测感受态的质量。阴性对照平板上应该无菌落生长,阳性对照平板上菌落数目的多少显示感受态效率的高低。
SOB的配制:
蛋白胨 20g
酵母提取物 5g
NaCl 0.58g
KCl 0.186g
100×Mg++溶液 10ml
溶解并加水定容至1L,121℃×20min高压蒸汽灭菌
100×Mg++溶液:
MgCl2﹒6H2O
MgSO4﹒7H2O
溶解并加水定容至100ml,121℃×20min高压蒸汽灭菌
TB溶液的配制:
1M KCl 5ml
0.55M MnCl2 2ml
0.5M CaCl2 0.6ml
0.1M K-Pipes(pH 6.7) 2ml
ddH2O 10.4ml
Total 20ml
注:上述溶液均需高压蒸汽灭菌处理
0.1M K-Pipes(pH=6.7)的配制:
称取3.02g Pipes粉末溶于80ml dd H2O中,此时粉末不能完全溶解,用10N KOH或KOH固体调节PH值,只有当PH接近6.7时粉末才能完全溶解,此时当小心少量地加入KOH直至达到所需PH值。