志贺氏菌核酸检测试剂盒（一管式PCR-荧光探针法）使用..
说明
致病菌检测系列可针对食品、饲料等样品中的致病微生物的特异核酸片段进行扩增，仪器实时监测扩增过程中的荧光信号变化，自动判读结果。本产品用于志贺氏菌的检测。检出限为103 CFU/ml。
◆ 产品组成（96测试）
|
011042LⅡ |
|
|
试剂 |
含量 |
|
A-Shi-P |
20μL × 8管× 12排 |
|
NG-P |
100μl× 3支 |
|
PG-Shi-P |
100μl× 2支 |
◆ 适用仪器
ABI 7500、CFX 96、Mx 3005P、LineGene9600等实时荧光PCR仪。
◆ 自备耗材和仪器
①冰盒；②移液器（0.5-10μL，10-100μL，100-1000μL）及配套灭菌吸头；③离心机；④涡旋混匀器；⑤金属浴；⑥均质机、搅拌机或研钵等研磨器具；⑦电子天平。
◆ 注意事项
1．本试剂检测灵敏度高。为了防止污染，实验要分区操作。
1）第一区：样本制备区。
2）第二区：模板添加区。
3）第三区：扩增及产物分析区。
分区之间最好进行物理性隔离，避免人为因素造成的污染。
2．实验过程中穿戴工作服和乳胶手套，不同区域独立使用工具，需更换手套和实验服。
3．严格按照操作步骤操作，试剂配制和加样等步骤请严格按照说明书要求在冰盒上操作。
4．反应液中的成分对光敏感，应避光保存。试剂使用前要完全解冻，但应避免反复冻融，推荐使用前离心30秒，并按检测频次将反应液以适当体积分管保存。
5．反应结束后，扩增管请置于密封袋内丢弃，当日清理，开盖易造成气溶胶污染，禁止开盖。
6．不同批号试剂请勿混合使用，在有效期内使用。
◆ 样品处理
参照《GB 4789.5-2012 食品安全国家标准 食品微生物学检验 志贺氏菌检验》中的5.1处理样品，对样品进行前增菌，制备的菌液保存待用。
以无菌操作取检样25 g（ml），加入装有灭菌225 ml志贺氏菌增菌肉汤的均质杯，用旋转刀片式均质器以8000 rpm/min～10000 rpm/min均质；或加入装有225 ml志贺氏菌增菌肉汤的均质袋中，用拍击式均质器连续均质1 min～2 min，液体样品振荡混匀即可。于41.5 ℃±1℃，厌氧培养16 h～20 h。
详细步骤请按照标准操作或查阅食安通软件。
◆ 实验操作
1. 模板制备（样本制备区）
建议使用试剂配套细菌组DNA提取系列产品，具体过程详见产品说明书。
2．添加模板（样本制备区，放置于冰盒中进行）
剪下所需测试数的已含有反应液的PCR管，放置在室温待解冻后，离心30秒后揭开封口膜，向每管反应液中分别加入5μL模板，顺序为NG、待测样品模板、PG-Shi-P。盖好配套的PCR管盖后，涡旋混匀30s，离心1min，立即进行PCR扩增反应。
3. 扩增反应（扩增及产物分析区）
使用荧光定量PCR仪，荧光基团选择FAM，淬灭基团选择TAMRA。
按下列条件设置扩增反应：
|
PCR循环 |
荧光收集位点 |
||
|
95℃ |
3分钟 |
1个循环 |
— |
|
94℃ |
5秒 |
40个循环 |
— |
|
60℃ |
40秒 |
※ |
4.基线和阈值设定
基线调整取3-15个循环的荧光信号，阈值线应超过阴性对照扩增曲线的最高点。
◆ 结果判定
检测样品无Ct值或≥40.0，曲线为直线或轻微斜线，无“S”型扩增曲线，可报告样品阴性，不含有志贺氏菌或含量低于检测限；
检测样品Ct≤35.0，曲线呈“S”型扩增曲线，可直接报告样品阳性，含有志贺氏菌；
检测样品35.0＜Ct＜40.0，需进行一次重复实验，若Ct值≥40.0则为阴性，否则为阳性。
NG反应为平滑直线，PG反应为“S”型扩增曲线且Ct值＜30，此次检测结果有效，否则无效。
