定量PCR的概念及方法介绍
1.利用参照物的定量方法
参照物是在定量 PCR 过程中使用的一种含量已知的标准品模板。按其性质的不同可分为内参照和外参照。外参照是序列与检测样品相同的标准品模板,外参照物与待检样本的扩增分别在不同的管内进行。通过一系列不同稀释度的已知含量外参照的扩增,建立外参照扩增前含量与扩增产物含量之间的标准曲线,以此用于未知样品的定量。因此,外参照定量 PCR 属非竞争性定量 PCR。
利用内参照物的定量方法与上述方法不同,它是将参照物与待检样本加入同一反应管中,参照物作为标准品模板与待检样品共用或不共用同一对引物,进行 PCR 扩增。按照内参照在扩增中是否与待检样品共用同一对引物,根据两个模板的扩增是否存在竞争性,内参照又可分为竞争性内参照和非竞争性内参照。
若内参照与待检样本共用同一对引物,两模板的扩增存在竞争性,则称为竞争性内参照,在这种条件下进行的定量 PCR 称竞争性定量 PCR。理想的竞争性内参照应具备以下特点:
①竞争性内参照模板与检测样品能共用同一对引物;
②内参照与待检样品长度相近,扩增效率相同;
③内参照扩增产物能方便地与待检样本扩增产物分开。在竞争性 PCR 中,首先通过一系列不同稀释度的已知含量的检测样品与已知含量的内参照混合共扩增,做出扩增前检测样品含量和内参照含量的比例与检测样品扩增产物含量的相关曲线,以此作为标准曲线用于待检样本的定量。若内参照与待检样本不共用同一对引物,两模板的扩增不存在竞争性,这时内参照又称为非竞争性内参照。这种 PCR 因其不存在竞争性,因而属于非竞争性 PCR。
2.竞争性定量 PCR
采用内参照竞争性定量方法,在准确性方面优于外参照的定量方法,是目前较理想的一种定量方法。其产物分析可采用探针杂交法、电泳法、HPLC 和荧光法等。由于采用内参照的竞争性定量,克服了常规 PCR 扩增效率不稳定的缺陷,各管间的差异得以避免。
竞争性 PCR 方法的总策略是采用相同的引物,同时扩增靶 DNA 和已知浓度的竞争模板,竞争模板与靶 DNA大致相同,但其内切酶位点或部分序列不同,用限制性内切酶消化 PCR 产物或用不同的探针进行杂交即可区分竞争模板与靶 DNA 的 PCR 产物,因竞争模板的起始浓度是已知的,通过测定竞争模板与靶 DNA 二者 PCR 产物便可对靶 DNA 进行定量。
利用竞争 PCR 亦可进行 mRNA 的定量。先以 mRNA 为模板合成 cDNA,再用竞争 PCR 对 cDNA 定量。但当逆转录效率低于100%时,通过测定样品中 cDNA 进行 mRNA 定量,则测定结果会偏低。
3.荧光定量 PCR
荧光定量 PCR(FQ-PCR)是新近出现的一种定量 PCR 检测方法,可采用外参照的定量方法,也可采用内参照的定量方法。荧光定量 PCR 采用各种方法用荧光物质标记探针,通过 PCR 显示扩增产物的量。由于荧光探针标记方法的不同,可分为不同的方法,并可借助专用的仪器实时监测荧光强度的变化。因此,这种方法可以免除标本和产物的污染,且无复杂的产物后续处理过程,因而该方法准确、高效、快速。
早期荧光定量 PCR 有许多局限性,如不能准确定量或由于太灵敏而容易交叉污染,产生假阳性。直到最近,荧光能量传递技术(fluorescence resonance energy transfer,FRET)应用于 PCR 定量后,上述问题才得到较好的解决。FRET 是指通过供、受体发色团之间偶极-偶极相互作用,能量从供体发色团转移至受体发色团,使受体发光。
