逆转录PCR概念及方法介绍
逆转录 PCR
RT-PCR(reverse transcriptase PCR,RT-PCR)是一种 RNA 逆转录和 PCR 结合起来建立的 RNA 的聚合酶链反应。RT-PCR 使 RNA 检测的敏感性提高了几个数量级[较 Northern 印迹杂交敏感(3～6)×103倍],也使一些极微量 RNA 样品分析成为可能。
RT-PCR 的关键步骤是 RNA 的逆转录,要求 RNA 模板必须是完整的,不含 DNA、蛋白质等杂质。用于该反应的引物可以是随机六聚核苷酸或寡聚脱氧胸苷酸(oligo dT),还可以是针对目的基因设计的特异性引物(GSP)。研究提示,使用随机六聚引物延伸法的结果较为恒定,并能引起靶序列的最大扩增。一般而言,1μg 细胞 RNA 足以用于扩增所有 mRNA 序列(1～10拷贝/细胞)。一个典型的哺乳动细胞含约10pg RNA。1μg RNA 相当于10万个细胞的 RNA 总量。
1.逆转录反应
①20μL 反应体系包括:1mmol/L dNTP;100mmol/L Tris-HCl,pH 8.4;50mmol/L KCl,2.5mmol/L MgCl2;100mg/mL BSA;100pmol 随机六聚寡核苷酸或 oligo dT 引物;1～9μL RNA 样品,80～200U 逆转录酶(M-MLV 或 AMV)。②混匀后,置室温10min,然后置42℃,30～60min。③若需重复一次逆转录反应,则95℃ 3min,然后补加50U 逆转录酶后重复第②步。④95℃ 10min 灭活逆转录酶,并使 RNA-cDNA杂交体解链。
2. PCR 操作
①将20μL 逆转录物加入80μL 含上、下游引物各10～50pmol的 PCR 缓冲液[100mmol/L Tris-HCl(pH 8.4);50mmol/L KCl;2.5mmol/L MgCl2;100mg/mL BSA]中混匀。②加1～2U Taq DNA 聚合酶和100μL 石蜡油。③根据待分析 RNA 的丰度决定循环数的多少。④用200～300μL TE 缓冲液饱和的氯仿抽提去除石蜡油。⑤离心,取上层水相5～10μL,用凝胶电泳分析 PCR 产物。
RT-PCR 也可以在一个系统中进行,称为一步法扩增(one step amplification),它能检测低丰度 mRNA 的表达。即利用同一种缓冲液,在同一体系中加入逆转录酶、引物、Taq 酶、4种 dNTP,直接进行 mRNA 逆转录与 PCR 扩增。由于发现 Taq 酶不但具有 DNA 聚合酶的作用,而且具有逆转录酶活性,因此,在同一体系中直接使用 Taq 酶,以 mRNA 为模板进行逆转录和其后的 PCR 扩增,使 mRNA-PCR 步骤更为简化,所需样品量减少到最低限度,对临床少量样品的检测非常有利。用一步法扩增可检测出总 RNA 中小于 1ng 的低丰度mRNA。该法还可用于低丰度 mRNA 的 cDNA 文库的构建及特异 cDNA 的克隆,并有可能与 Taq 酶的测序技术相结合,使得自动逆转录、基因扩增与基因转录产物的测序在一个试管中进行。
