western-blot操作注意事项（二）

2020.5.05

五．封闭及杂交

1．封闭：

将膜从电转槽中取出，去离子水与PBST或TTBS稍加漂洗，浸没于封闭液中缓慢摇荡一小时。必要时可先用丽春红染色（2%乙酸，0.5%丽春红的水溶液）观察蛋白条带，再用去离子水和TTBS将丽春红洗脱后封闭，如用蛋白marker则可省略此步。

2．结合一抗：

一抗的准备：使用反贴法时每张3×9cm2膜约需2ml一抗稀释液。

反贴法的操作：含一抗的封闭液滴加于摇床的塑料膜上，将Western膜从封闭液中取出，滤纸贴角稍吸干，正面朝下贴在一抗上，注意不要留下气泡，室温下轻摇孵育一小时或4℃静置过夜。在反应体系外面罩一湿润平皿以防止液体过多蒸发。

3．洗涤：

一抗孵育结束后，用PBST或TTBS漂洗膜后再浸洗三次，每次5-10min。

4．结合二抗：

根据一抗来源选择合适的二抗，根据鉴定方法选择HRP或AP标记的抗体，按相应比例稀释（1:1000~1:10000），室温轻摇一小时。

5．洗涤：

二抗孵育结束后，用PBST或TTBS漂洗膜后再浸洗三次，每次5-10min。

六．发光鉴定

一般使用辣根过氧化物酶HRP-ECL发光法或碱性磷酸酶AP-NBT/BICP显色法。

1．HRP-ECL发光法：

将A、B发光液按比例稀释混合。膜用去离子水稍加漂洗，滤纸贴角吸干，反贴法覆于A、B混合液滴上，熄灯至可见淡绿色荧光条带（5min左右）后滤纸贴角吸干，置于保鲜膜内固定于片盒中，迅速盖上胶片，关闭胶盒，根据所见荧光强度曝光。取出胶片立即完全浸入显影液中1-2min，清水漂洗一下后放在定影液中至底片完全定影，清水冲净晾干，标定Marker，进行分析与扫描。

2．AP-NBT/BICP显色法：

每片NBT/BICP可溶解于30ml水中，使用前将一片分装在30个 EP管中，每张3×9cm的膜取一管配成1ml即可。将PBST或TTBS洗涤过的膜用去离子水稍加漂洗，滤纸贴角吸干，反贴法覆于NBT/BICP溶液液滴上，并用不透明物体（如报纸）遮挡光线，显色20s后每10s观察一次，至条带明显或有本底出现时将膜揭起置去离子水中漂洗后放滤纸上晾干即可观察与扫描。

七．增强敏感性

若目的条带未出现，或很淡，可试用以下方法增强发光强度：

1．用清水漂洗膜数分钟，重加发光液进行曝光，可延长曝光时间。

2．将膜在PBST或TTBS中洗涤30min或更长，期间至少换2次液。

3．封闭40~60min

4．一抗杂交，室温1h。37℃ 1h 会更强，但可能增加非特异条带。

5． PBST或TTBS洗膜20min，期间换2次液。

6．二抗杂交，37℃ 1h。

7． PBST或TTBS洗膜20min，期间换2次液。

8．发光鉴定。

9．若条带仍未出现或很淡，可以再用PBST或TTBS洗涤膜20min，期间换2次液。

10．三抗杂交，室温1h。37℃ 1h 会更强，但可能增加非特异条带。三抗即抗二抗的二抗，比如二抗用羊抗兔，此时三抗可以选择兔抗羊或鼠抗羊等。