1. 0.25 %胰蛋白酶消化处于对数生长期的L929细胞 2. 用RPMI1640洗涤细胞后,调整细胞浓度至2×106 /ml 3. 加入3H-TdR,20 μci/ml 4. 置37 ℃,5 %CO2培养箱中2~3 h,摇动1 次/30 min 5. 用RPMI1640洗涤2次,800 rpm×5 min/次 6. 调整细胞浓度至2~3×105 /ml后,加入96孔培养板中,100 μl/孔 7. 加入不同稀释度的待测样本(设三个重复孔) 8. 加入放线菌素D,使放线菌素D最终浓度至1 μg/ml,用时设放线菌素、完全培基阴性对照和rTNF-α标准品阳性对照,37 ℃,5 %CO2培养中24 h 9. 加入3 %胰蛋白酶和0.25 %DNA酶各10 μl/孔,37 ℃,30 min 10. 用DYQ-Ⅱ型多头细胞收集器收集样品于"9999"型玻璃纤维滤纸上 11. 烤干后,进行β计数 12. 结果判定 (1)TNF-α作用24 h后,在倒置显微镜下判定50 %L929细胞杀伤的稀释度即为1个TNF-α活性单位。 (2)根据测得的cpm值按下列公式计数活性单位 放线菌素D对照组cpm-实验组cpm TNF-α活性单位(U/ml)=──────────×标准品活性单位×待测样品稀释倍数 放线菌素D对照组cpm-标准品cpm 展开 |