靶向FGFR3胞外区域的人scFv抗体的筛选和活性研究（二）
噬菌体ELISA
使用0.3ug的FGFR3，FGFR1或者人IgG蛋白包被微孔板，洗涤，封闭，加入不同浓度前面筛选纯化后的噬菌体悬浮液。孵育后，加入HRP-抗M13抗体，加入底物显色，450nm读取结果。
单克隆噬菌体ELISA
经过两轮或三轮的筛选后收获的噬菌体经过培养生长出克隆，然后使用QPix高通量自动化克隆筛选系统(Molecular
Devices)挑取单克隆到含有100ul
2TY培养基的96微孔板，37度培养，第二天使用相同培养基对培养物1:100稀释，然后37度震荡培养2小时，加入25ul含有109辅助噬菌体KM13的2TY培养基，继续培养1小时。菌体经过离心，重悬于2TY培养基，30度过夜培养。最后，离心，取50ul上清，进行单克隆噬菌体ELISA分析。
可溶性scFv抗体的表达纯化和ELISA检测
获得的高特异性克隆，使用E.coli
HB2151诱导表达，离心收获菌体，提取细菌周质腔蛋白，最后使用亲和色谱纯化。纯化的各组分使用SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色分析。纯化的组分进一步使用分子筛层析分离出scFv蛋白的单体(scFv容易发生二聚体或者多聚体)。
表面等离子体共振分析
使用BiacoreX分析可溶性scFv和FGFR3的结合动力学，并且计算获得每个纯化的scFv的Kd值；使用竞争性结合分析确定每个scFv的特异性结合位点。使用同样的方法分析scFvs和FGF9，FGF1以及EGF是否能竞争结合FGFR3。
流式细胞仪和共聚焦显微镜分析
使用流失细胞仪分析噬菌体scFv和纯化后可溶性scFv在细胞水平上和FGFR3的结合活性。通过处理RT112细胞，然后使用共聚焦显微镜进一步分析抗体结合活性。
细胞增殖分析
使用不同浓度的抗FGFR3 scFvs抗体(0.02-2umol/L)处理RT-112细胞，48小时后，使用MTT对细胞进行染色，然后570nm读数。细胞活力通过下面公式计算：Abs-scFv处理的细胞/Abs-对照组细胞。
结果
筛选FGFR3特异性scFv抗体：如表1所示，总共随机挑选了288个克隆，通过ELISA检测，获得15个FGFR3特异性的抗体克隆。通过测序发现，15个克隆里面有6个克隆的序列是唯一的。3A和1D序列内部有一个终止密码子，只在VL的CDR2区有一个碱基突变。其他4个克隆的序列有比较大的区别，主要区别集中在CDR2和CDR3。其中CDR3在VH和VL都是高度可变的，CDR2的突变主要集中在VH。
ELISA特异性鉴定发现：如图2所示，尽管FGFR1和FGFR3具有高度同源性(>62%)，6个筛选到的scFv克隆都对FGFR3具有显著的结合特异性；相反和FGFR1的结合活性非常弱，和阴性对照人IgG的反应结果类似。
图2：ELISA检测筛选到的可溶性scFvs结合特异性。从培养上清中获得的scFv-pIII融合蛋白，通过ELISA方法检测和FGFR3-Fc(黑色)，FGFR1-Fc(灰色)以及阴性对照人IgG(白色)的结合活性。
使用Biacore分析了纯化后单体scFv抗体和FGFR3的亲和力。如表2所示，检测了不同scFvs的Kon，Koff以及Kd值。Kd值在40.9和12.4nmol/L之间变化，表明筛选到的scFv具有中等到较高的亲和活性。如果考虑了使用的噬菌体的库容只有1.6*108，属于中等大小库容，这个结果已经非常好了。
