以AtT20脑垂体细胞作为模型进行神经内 分泌肽能...（一）
以AtT20脑垂体细胞作为模型进行神经内 分泌肽能系统干扰中的蛋白质组学分析实验
实验步骤
一、材料
1 细胞培养和裂解
（1）小鼠脑垂体 AtT20 和 AtT20 (proSAAS) 细胞系。 AtT20 .(proSAAS) 细胞系通过用包含一个新霉素抗性基因的 proSAAS 表达载体转染 AtT2 0 细胞，再利用该基因对细胞毒性药物 G4 1 8 的抗性挑选阳性细胞得到（11)。
（2）含有 1 0 % 胎 牛 血 清（Wisent Inc. ， Quebec, Canada) 和 30 pg/m L 硫酸双生霉素的 DMEM 培 养 基（Gibco/BLR, Grandlsland, N Y)，含或不含 500 pg/mL的 G418 (Gibco/BLR)。
（3）磷 酸 盐 缓 冲 盐 溶 液（PBS): 1. 35 mol/L 的 NaCU 28 mmol/L 的 KC1， 80mmol/L 的 Na2 HPO4 • 7 H20 ， 15 mmol/L 的 KH2PO4， pH 7. 2。
（4）Versine: 含 0.I mmol/L EDTA 的 PBS。
（5）缓 冲 液 B: 10 mmol/L 羟 乙 基 哌 嗪 乙 磺 酸（HEPES) -KOH， pH 7.4， 10mmol/L KC1, I.5 mmol/L MgCl2，0.5 mmol,』L EGTA 钠 ， I mmol/L 二硫苏
糖 醇（DTT)。
（6）蛋 白 酶 抑 制 剂（ PIC) 片 剂（Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany): 一片 溶 于 10 m L 缓 冲 液 B
（7）Corning 细 胞 刮 刀（Sigma-Aldrich, St Louise, MO)。
（8）注 射 器（3 mL) 和 针 头（2 6 目）。
（9） 蛋白质浓度测定试剂盒（Bio-Rad, Hercules, CA)。
2 双向凝胶电泳
（1）IPGphor 胶条槽， 18 cm (AmershamBiosciences, Piscataway, NJ)。
（2）IPGphor 等电聚焦系统（Amersham Biosciences)。
（3）Hoeffer DALT 电泳系统（Amersham Biosciences)。
（4） pH 4〜7L 的固相 pH 梯 度（IPG) 胶条， 18 cm (Amersham Biosciences， Uppsala， Sweden)。 保存于一 20°C 。
（5）水 化 上 样 缓 冲 液（RB) : 7 m o l/L 尿 素 ， 2 m o l/L 硫 脲 ， 4 % CHAPS,1 % DTT
（6）BiaLyte 3/10 两性电解质（Bio^Rad)。保存于 4°C 。
（7）矿 物 油（Bio——Rad)。
（8）IPG 胶条平衡缓冲液（EBl): 50 mmol/LTris-HCl， pH 8.8, 6 mol/L 尿素，30% (V/V) 甘油， 2 % 十二烷基磺酸钠（SDS)， 1 % DTT, 1X 10-4% 溴酚蓝。
（9）IPG 胶条平衡缓冲液（EB2): 50 mmol/L Tris-HCl, pH 8.8, 6 mol/L 尿素，3 0 % (V/V ) 甘油， 2 % SDS， 4 % 碘乙酰胺， 1X 10-4% 溴酚蓝。
（10） 甲叉双丙烯酰胺溶液（30_8%T ) (神经毒，戴手套!）： 3 0 % 丙烯酰胺， 0.8%
甲叉丙烯酰胺。保存于 4°C 。
（11）1 0 % SDS。
（12）1 0 % 过硫酸胺。
（13） 四甲基乙二胺（TEMED， BitRad)。
（14） SDS 电泳缓冲液： 25 mmol/L Tris, 192 mmol/L 甘氨酸， 0.1% SDS。
（15）低熔点琼脂糖（LMT) (Gibco/BLR)。通过微波炉加热溶解 1 % L M T 至 SDS电泳缓冲液中。在使用前保持 50°C 。
（16）银染溶液：a固定液： 3 0 % 乙醇， 5 % 乙酸；b 敏化液： 0.02% 硫代硫酸钠；c银染试剂： 0 . 2 % 硝酸银。d 显影液： 4 % 碳酸钾， 0.025% 甲醛(37%); e 停显试剂： 4 % Tris 碱 ， 2 % 乙酸。
（17）Umax Powerlook 1100 扫 描 仪（Umax Technologies, Dallas, TX)。
3 基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱（MALDI-TOFMS)
（1）胰蛋 白 酶（cat.no. V5111， Promega, Madison， WI)。
（2）ZipTip (：18 移 液 吸 头（Millipore， Bedford, MA)。
（3） 基质溶液： 10 m g/m L 的 a-氰-4-羟基肉桂酸溶于含〇.1% 三氟乙酸的 50% 乙腈。
（4）Voyager DETm-P R O 基 质 辅 助 激 光 解 吸 电 离 - 飞 行 时 间 质 谱（MALDI-TOF)(PerSeptive Biosystems, Framingham, MA)。
（5）MALDI 板（PerSeptive Biosystems， Framingham, MA)。
