以AtT20脑垂体细胞作为模型进行神经内 分泌肽能...（二）
4 免疫印迹
（1） 硝酸纤维素膜（Bio-Rad)。
（2）Towbin 缓冲液： 25 mmol/L Tris, 192 mmol/L 甘氨酸， 0.1% SDS， 2 0 % (V/V) 甲醇。
（3）IX T ris 缓 冲 盐 溶 液（1XTBS): 10 mmol/L Tris-. HCl， pH 8_0， 150 mmol/L NaCl
（4） TBS——T : I X TBS, 0.1% Tween-20。
（5）5 % 脱脂牛奶溶液： TBS^T , 5 % 脱脂牛奶。
（6）ECL™ 抗兔抗体，辣根过氧化物酶链接的 F Ub’)2 片 段（来自驴）（ AmershamBiosciences)„
（7）Western Lightning 化学发光试剂（PerkinElmer, Boston, MA)。
二、方法
1 样本制备
（1）将 AtT2 0 和 AtT20 (proSAAS) 细 胞 用 150 m m 的 培 养 皿 培 养（每 种 细 胞 3盘），加 人 DMEM，在 37°C ， 5 % C0 2- 9 5 % 空 气 的 润 湿 环 境 中 生 长 至 满 。AtT20 (proSAAS) 的培养基添加了 500fxg/mL 的 G418。
（2）每次用 10 m L 的 PBS 漂洗单层细胞 3 次。
（3）用 Versine 覆盖细胞；用细胞刮刀将细胞从板上刮下，将细胞悬液转移到离心管中。
（4）4°C 1300 g 离心 5 min 沉淀细胞。移出并丢弃上清液。
（5）如上所述再次离心来移去残留的 Versine。
（6）用 0.5 mL 的含 PIC 的缓冲液 B 重悬细胞，用带有 2 6 目针头的注射器推拉 3 0 次来破裂细胞。
（7）将裂解产物 4°C , IOOOg 离 心 7 min。将上清液转移到新管子中并丢弃沉淀。
（8） 4°C 下 l 〇 V 离心上清 30 min，将 上 清 液（细胞质成分）转移到新的管子中并保
留 沉 淀（微粒体成分)。
（9）加 3 倍体积的丙酮到每份细胞质成分中并置于一 20°C lh ，沉淀蛋白质。 4°C 下15 800 g离 心 15min 。弃去上清液，保留沉淀。
（10）用超声处理法将每份细胞质沉淀或微粒体蛋白溶于 500 的 R B 中（见注释1)
（11）使用 Bio——Rad 蛋白质浓度测定试剂盒， Bradford 法确定蛋白质浓度。
2 双向电泳
2.1 等 电 聚 焦（IEF)
2.2 十 二 烷 基 磺 酸 钠 - 聚 丙 烯 酰 胺 凝 肢 电 泳（SDS^P A G E )
3 银 染（19)
3.1 银 染（见 注 释 7)
以下步骤在振荡中进行。
(1)将凝胶浸在固定液中 30 min。
(2)更换固定液再振荡 30 min。
(3)用水漂洗凝胶 5 次 ，每 次 5 min。
(4)在敏化液中孵育凝胶 lmin。
(5)用水漂洗凝胶 2 次 ，每 次 lmin。
(6)在银染试剂中孵育凝胶 30 min。
(7)用水漂洗凝胶 2 次 ，每 次 lmin。
（8）在显影液中孵育凝胶直到蛋白质斑点出现。
（9）用停显试剂终止显影 30 min。
（10） 用水漂洗凝胶 3 次，每 次 5 min。
3.2 2D 图像获取
银染凝胶在 Umax Powerlook 1100 扫 描 仪（图 1 ) 上扫描，保存数子图像。
4 银染胶脱色 （20)
（1）切取感兴趣的凝胶斑点。
（2）按 1 : 1 的比例混合 30 mmol/L 的铁氰化钾和 100 mmol/L 的硫代硫酸納。
（3） 用 100 uL 以上溶液覆盖凝胶片。
（4） 室温下振荡直到银染去除。
（5） 每次用 500 uL 水漂洗凝胶片，并更换水数次直到黄色试剂去除。
（6） 在 200 uL 200 mmol/L 的碳酸氢氨中孵育凝胶片 20 min 并振荡。
（7）用 500 水漂洗凝胶片 2 次 ，每 次 lmin。
（8）离心并除去水。
5 胰 酶 消 化 （21， 22)
(1)将凝胶片在 200 uL CH3CN 中孵育 10 min。
(2)离心并除去 CH3CN。
(3)SpeedVac 真空离心蒸发浓缩凝胶片 15 min。
(4)56°C 下在 100 )nL 100 mmol/L NH4 HCO3, 10 mmol/L DTT 中孵育凝胶片45 min
(5)离心并除去 D T T 溶液
(6)加 100 100 mmol/L NH4 HCO3， 55 mpol/L 碘乙酰胺，并在室温下黑暗中孵 育 30 min。
(7） 离心并除去碘乙酰胺溶液。
(8)在 100 100 mmol/L NH4 HCO3 中振荡漂洗凝胶片 lOmin。
(9) 离心并除去 NH4 HCCV 溶液。
(10) 室温下在 100 pL CH3C N 中脱水凝胶片 5 min。
(11) 离心并除去 CH3CN
(12)在 100 uL 100 mmol/L NH4 HCO3 中振荡漂洗凝胶片 5 min。
(13)离心并除去 NH4 HCO3 溶液。
(14)室温下在 100 uL CH3CN 中脱水凝胶片 5 min。
(15)离心并除去 CH3CN。
(16)SpeedVac 真空离心蒸发浓缩凝胶片 15 min。
(17)在冰上用 20 含 500 ng 胰酶的 50 mmol/L NH4 HCO3 泡胀凝胶片 30 min。
(18)去除残留的胰酶溶液，并 加 50 mmol/L 无胰酶的 NH4 HCO3 覆盖凝胶片。
(19)37°C 下消化凝胶中的蛋白质过夜。
(20)离心并将上清转移到新會子中。
(21)加 50 uL 50% C H 3 C N , 0 . 1 % 三氟乙酸到凝胶片上并在冷水浴中超声处理 3 min。
(22)离心并转移上清到最初的上清中。
(23)再重复步骤 2 1 和 22 两次。
(24）SpeedVac 真空离心蒸发浓缩上清液直到体积小于 10 uL。
(25）加0 . 1 % 三 氟 乙酸至 10 uL 。
6 胰蛋白酶肽段 MALDI-TOF 质谱分析
（1）在 MALDI-TO F 分析之前，按照制造商说明书用 ZipTip C18 移液吸头纯化胰蛋白酶消化的肽段。
（2）将纯化的肽段用 2 uL 基质点在 M A L D I 板上。
（3）用以下仪器设定采用延迟提取和反射模式进行质谱分析： 20 k V 加速电压， 150ns 延迟时间， 7 0 % 栅极电压， 0.05% 导向线电压， 128 激光发射，激光强度2000, 质量门从 800 到 2800。m/z 842. 5 1 和 m/z 1045. 5 6 的胰酶自降解产物用于 内部质量校准（图 2)。
（4）选择单同位素峰的质量，通过使用搜索引擎 PeptIdent (http://www.expasy.ch/tools/peptident.html) 搜索 Swiss-Prot 和 TrEMBL 数据库，与相应理论质量匹配在 50 ppm® 之内来鉴定蛋白质。
7 2D 免疫印迹
（1）如 3. 2 所述重复制备 2D 凝胶。
（2）根据制造商用户手册，在 含 Towbm 缓冲液的 Hoefer SE 600 槽中将蛋白质点从未染色的凝胶上转移到硝酸纤维素膜上。
（3）用 5% 脱脂牛奶溶液封闭膜。
（4）室温下将膜在含抗-EphA2 —抗 的 5 ¼ 脱脂牛奶中孵育 lh 。
（5）在 TBS”T 中漂洗膜 4 次 ，每 次 5 min。
（6） 在 含 HRP-结合的驴抗兔 IgG 的抗体的脱脂牛奶溶液中孵育膜 lh 。
（7）在 T B S T 中漂洗膜 4 次，每 次 5 min。
（8） 根据制造商方案，用 Western Lightning 化学发光试剂显示免疫反应斑点（图3)。
注意事项
（1） 样品蛋白的完全增溶、去解聚、变性和还原是用 2D 凝胶分离蛋白质能否成功的关键。因此，蛋白质沉淀需在 R B 中用超声处理至少 3 min 以溶解。因为尿素在较高温度下可以降解为异腈酸盐，导致蛋白质氨甲基化，所以超声处理在冰水浴冷却下用 cuphorn 超声仪进行。
（2）IPG 胶条槽是用陶瓷制成的，使用时小心。
（3）为了避免污染，带手套工作。不要让 IPG 胶条下存留气泡。
（4） 这 里 用 来 制 备 溶 液 的 水 必 须 拥 有 以 上 的 电 阻 率 。
（5）20 cm 长带盖子的玻璃管用于平衡很理想。
（6）避免在 IPG 胶条和 SDS 胶之间存留气泡。
（7）银染是最敏感的可视化方法。为得到高质量的结果，应使用高纯度的试剂并戴手套以避免污染。
