DNA 新型分子探针应用于活细胞的力学可视化研究
北京时间 2021 年 5 月 31 日晚 23 时，武汉大学高等研究院刘郑课题组在Nature Cell Biology杂志上发表研究论文 ——A Reversible shearing DNA probe for visualizing mechanically strong receptors in living cells。
文中介绍了一种基于 DNA 结构的新型分子荧光张力探针并应用于活细胞的力学可视化的研究，该探针集成了目前已发展的 DNA 力学传感器的多种优点，可以可逆的对细胞膜上单个蛋白上传递的 4-60 pN 范围的机械力进行长时间成像，是此前可逆传感器测量范围的 3 倍
(该范围几乎覆盖了大多数力学信号传导过程)，并且该分子结构还可以进一步改造成光控力学探针，通过光控切割来改变 DNA 力学探针的机械结构，使其瞬间从可逆状态转成不可逆状态，进而可以用于限制细胞力学的大小，研究特定机械信号通路的生物学功能。
利用这一类力学探针，研究人员展示了可以在不扰乱粘附生物学的情况下，轻松地分辨出蛋白受体在力学传递过程中的物理差异，并对这些力学信号进行长时间可视化实时追踪。观察到了细胞迁移过程中存在一类少量、但传递着更强力学信号的整合素受体蛋白团簇（称为「力学热点」），进一步揭示了这些「力学热点」调控了细胞黏附行为、黏着斑的生长过程以及细胞迁移等重要的细胞生物学过程。
电学、化学和力学是细胞内最常见的三大信号系统，它们相互协调，共同维持着细胞的生命活动。前两者已被人们广泛研究，而细胞的机械力信号传递过程因缺少有效的研究方法，人们一直对其认识有限。
研究表明，细胞在体内拥挤的环境中不仅通过挤来挤去以获得足够的生存空间，同时，细胞的生命过程也不断的受到挤压、拉伸、弯曲和拉扯细胞外基质（ECM）等过程产生的机械力调控。尽管细胞上每个受体上传递的机械力小得令人难以置信 ---分布在几 pN 到几十 pN 的范围，但是这些机械力信号可以深刻影响着胚胎发育、肿瘤迁移、免疫识别等多种过程。因此，在空间和时间上对细胞机械力进行精准地表征，将可以帮助我们深入认识细胞如何利用微观力学信号诱导和改变相关的生物化学信号 [1,2]。
近十年来，基于分子力学传感器的力学可视化技术的提出，使得我们可以在分子水平上窥探细胞机械力传递过程和机制 [2-5]。但是，目前报道的多种分子力学传感器难以兼顾测量范围和可逆测量的需求，这限制了我们对细胞机械力信号传导的研究。
在这项新研究中，首先，作者提出了一种可逆的剪切模式 DNA 发卡结构的力学探针，其双链的耐受力阙值可以通过改变发卡的力学结构而进行大范围的调节，打开该 DNA 结构所需的机械力由受力的位置和 DNA 发卡的自由能共同决定。
为了合成出该探针，作者设计了一套该 DNA 探针的化学修饰、合成以及纯化策略。当 DNA 发夹处于折叠状态时，其探针的荧光团被淬灭剂（BHQ）和 Au NP 通过荧光共振能量转移（FRET）和纳米表面能量转移（NSET）两种途径高度淬灭，从而提高了张力探针的力学敏感性。一旦细胞通过探针上的配体对 ECM 施加机械力，并达到该探针的展开阙值力，DNA 探针结构展开分离荧光分子和淬灭剂，随即点亮该探针。通过该过程，可将单个蛋白质上传递的微观机械力信号转化成荧光信号进行观测。由于发卡机构中 loop 结构的存在，当牵引力减小到一定程度时，DNA 发卡结构会自然关闭，进而可以对细胞的机械力进行实时成像。
图 1. 可逆的剪切模式 DNA 发卡结构的力学探针原理及用于细胞力学可视化研究。
基于该力学探针对胚胎成纤维细胞在铺展和迁移过程中整合素 (Integrin) 介导的不同大小的机械力进行长时间成像，研究人员发现细胞的黏着斑结构中，integrin 力的分布明显是不均匀的，黏着斑中间的少量的 integrin 组成的团簇承受了一个巨大强度的机械力（>60 pN, 该 integrin 团簇称为「力学热点」）, 并发现这些「力学热点」类似于高楼大厦的承重墙，对促进黏着斑的成熟以及维持整个结构的稳定具有很重要的作用。
研究结果表明，对于新生的黏着斑，integrin 分子所承受力的大小直接影响这些新生黏着斑能否成长为更成熟、更稳定的结构。如果没有承受较大力的整合素（称为「strong」integrin）存在，黏着斑的寿命明显偏低。为了深入探索这些「strong」
integrin 功能，作者进一步设计了一种可以光控切割的 DNA 力学探针，并在成熟的黏着斑结构中，用光选择性地瞬间切断黏着斑中极其稀少的「strong」integrin 与 ECM 的衔接，发现黏着斑结构会迅速解聚，单分子力学成像实验进一步证实这些「strong」integrin 可以在单分子水平上调控 FA 结构的组装和寿命，进而影响着细胞迁移。
此外，作者利用该探针具有极高灵敏度优势，研究了胞内 actin 自组装聚合时所产生的微弱力学信号特征，并利用单分子成像和荧光漂白计数等方法对单个 integrin 团簇中受力蛋白进行了量化和功能研究。
图 2: 光控分子力学探针原理以及应用于特定力学受体功能的研究。
综上所述，该工作设计出一种新型 DNA 结构的荧光张力探针并应用于活细胞机械力可视化研究，具有力学量程宽、可逆、单分子灵敏度等优势，并可以用光来控制该探针的机械结构进而达到控制细胞力的功能。通过对细胞迁移过程中 integrin 介导的机械力进行研究，发现了一类少量、但传递更强机械力的 integrin 在细胞运动过程扮演着重要角色。该技术有望成为研究肿瘤细胞迁移、免疫细胞的识别和激活等机械力深度参与的生命过程的重要工具。
武汉大学高等研究院博士生李洪云为第一作者，刘郑教授为该论文的通讯作者。合作者包括武汉大学生命科学学院张兴华研究员以及博士生张晨同学（负责探针的标定），以及中山大学物理系马杰教授。该课题得到了国家自然科学基金委以及武汉大学启动经费的支持。
刘郑教授课题组目前主要从事开发多种功能的分子 — 细胞力学研究技术，并利用这些技术深入研究机械力在肿瘤迁移、免疫细胞识别和激活以等过程中扮演的角色和分子机制。
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