肽质量指纹图谱—MALDI-TOF 法鉴定蛋白质实验（一）
实验材料 测序级猪胰蛋白酶
试剂、试剂盒 碳酸氢铵碳酸氢铵缓冲液乙腈 碳酸氢铵缓冲液消化缓冲液
仪器、耗材 真空离心机烤箱
实验步骤
许多凝胶染色方法适用于后续的 MALDI-TOF 肽质量指纹图谱（PMF ) 分析。在第 14 章已经比较讨论了一些染色方法的性能和兼容性。
3.1 胶内消化
凝胶消化方法改编自 Jensen 等。
对于凝胶处理和消化步骤，必须认真处理样品，尽量减少外源性角蛋白的污染（如头发、皮肤、羊毛衣服、气流、通风冷却等）（见注释 1)。
1. 从二维聚丙烯酰胺凝胶挖蛋白质点
( 1 ) 将 1 ml 枪头在离尖端 5 mm 处用刀片切除，做一个打孔器（切口直径 1~2 mm ) ( 见注释 2) 。
( 2 ) 挖取凝胶点，并转移到离心管中。
2. 清洗凝胶碎片
( 1 ) 用 100 μl 碳酸氢铵缓冲液清洗（振荡 15 min) ，然后弃上清液。
( 2 ) 用 100 μl 乙腈/碳酸氢铵缓冲液洗两次（振荡 15 min) ，然后弃上清液。
( 3 ) 用 100 μl HPLC 级乙腈清洗（振荡 15 min) 使凝胶碎片收缩，然后弃上清液。
( 4 ) 离心式蒸发器上真空干燥凝胶碎片。
经上述洗涤后，凝胶片段在 -20°C 可以贮存几个星期，可再用于凝胶消化。
对于二维凝胶，在凝胶消化之前没有必要进行半胱氨酸残基的还原和烷基化（见注释 3)。
3. 胶内消化（见注释 4 和注释 5)
( 1 ) 将凝胶碎片置于冰上（见注释 6)，加入 8 μl 冷却的消化缓冲液。
( 2 ) 20 min 后，用少量碳酸氢铵缓冲液调整以覆盖凝胶。
( 3 ) 37°C 温育 4 h ( 或过夜，见注释 7) 。
4. 多肽片段的提取、浓缩、脱盐
1 ) 多肽片段的提取
( 1 ) 加入 20 μl TFA 溶液（超声 15 min) ，提取胰蛋白酶消化产生的多肽片段。上清液保存在 500 μl 离心管中。
( 2 ) 用 20 μl 的 3 : 2 乙腈/TFA 液提取（超声 15 min) 。收集上清液。
2 ) 肽浓缩和脱盐
( 1 ) 通过真空离心机将上清液浓缩到大约 10 μl 的体积。这一步去除乙腈（否则多肽片段将不能固定在疏水色谱介质），并减少体积量至合适的范围以便能进行下一步的色谱操作。
( 2 ) 牢牢固定 ZipTip 在 10 μl 的可调移液管上（背压可能很高）。
( 3 ) 用 10 μl 的 3 : 2 乙腈/TFA 溶液清洗 ZipTip 5 次。去除清洗液。
( 4 ) 用 10 μl 的 TFA 溶液平衡 ZipTip 5 次 。去除清洗液。
( 5 ) 不用抬高吸管尖头，慢慢吸出和分散 10 μl 浓缩上清液 10 次，固定住肽片段。
( 6 ) 用 10 μl TFA 溶液清洗固定的肽（脱盐）4 次。去除清洗液。
( 7 ) 用 2 μl 的 1:1 乙腈/TFA 溶液洗脱多肽片段至 500 μl 微量离心管中。
3.2 MALDI-TOF 肽质量指纹图谱
( 1 ) 在 MALDI 过程中，样品通常是与芳香有机物共结晶出来。这些有机物通常是酸性化合物（基质），主要性质是吸收紫外激发波长（一般为氮激光的 337 nm 波长或三倍频率的 Nd: YAG 激光的 355 nm 波长）。在解吸过程中，当紫外激光发射时，基质的芳香基团（大量存在，超过 10000 : 1 ) 吸收紫外能量，导致基质升华为气态，不致于使样品分解或解离。
( 2 ) 电离过程是发生在带电的基质离子和中性的肽片段之间（离子-分子反应）的高浓度、不停扩张和冷却的气相质子交换过程。
( 3 ) —旦解吸和电离，TOF 管中的样品加速冲向探测器，它的速度（在固定长度飞行管的 TOF) 与 m/z 的均方根成正比。
( 4 ) 该反射镜（静电镜）修正初始动能分布，因而能提高质量分辨率和质量准确度 ( 具有较大动能的等压离子在反射镜中有更大的路径，在探测器聚焦平面以较低的动能 )。
( 5 ) 延迟或脉冲离子的萃取会纠正初始空间分布，因而再次提高分辨率和质量准确度（根据离子从源头到分析仪提取开始时的位置，解吸室的等压离子将会加速空间分布)。
现在有许多涉及 MALDI-TOF 和 MS 基本知识的专业文献或书，也可参阅它们。
MALDI-TOF 质谱技术是 PMF 的首选，主要是因为 MALDI-TOF 具有一些优势特点。
( 1 ) 软电离技术（在 MALDI 过程中肽片段能保持完整)。
( 2 ) 电离方法也适合不同多肽混合物的分析，该方法较耐污染（缓冲液、盐、增塑剂等) 。
( 3 ) 方法灵敏度高（有 MALDI 过程和 TOF 质量分析仪) 。
( 4 ) 良好的分辨率，目前已经超过 15000 [ 全宽，半质量（FWHM )] ，在感兴趣的质量范围可检测单一同位素峰。
( 5 ) TOF 分析仪具有很高的质量精度（通常为 10~30 ppm) 。
( 6 ) 能快速得到实验数据。
