巧用单细胞测序解析生发过程的深层次调控机制（二）
图2 单细胞测序结果tSNE细胞分类结果
为进行更加精细的分类，研究人员对由巨噬细胞marker表达的细胞进行了重新分类，共产生7个新的分类亚群。这些巨噬细胞簇显示出相对均一的CD68表达，但相对于经典炎症和抗炎标记物是异质的。其中，Cluster 3主要表达抗炎症marker Mrc2(CD206)和CD163，而Cluster 0和1主要表达炎症marker IL-1b和MHC II（H2-Ab1）。值得注意的是，OSM主要局限性地在新分类中的Cluster 6中表达。
8. 产生OSM的巨噬细胞是TREM2+且有着独特的基因表达谱
通过对每个cluster中的显著上调基因进行聚类，可以发现Cluster 6 细胞和“M2-like”的Cluster3表达模式很相似。有意思的是，这两类细胞可以用TREM2 marker区分来开，TREM2特异性地在生产OSM的Cluster 6中表达。
利用在线资源Enrichr对cluster 6的基因分析发现，其功能主要与小神经胶质相关，是中枢神经的长期组织驻留巨噬细胞。小神经胶质细胞相关的marker（Apoe,Aif-1,Cx3cr1和Tmem119）都在该类细胞中由表达。因此，OSM和TREM2是culster 6中特异性高表达的基因。
图3 产生OSM的巨噬细胞的表达特征谱
9. TREM2+巨噬细胞与HFSCs关系密切
研究人员对小鼠真皮组织选取30 μm组织块进行markers免疫荧光检测，发现Aif-1和CD11b与OSM在P45期的毛囊免疫细胞中共定位；TREM2和F4/80与OSM在靠近休止期HFSCs的巨噬细胞中共定位。这部分的结果表明，OSM由处于休止期HFs中的TREM2+巨噬细胞产生。
10. 休止期后TREM2+巨噬细胞会减少
如果TREM2+巨噬细胞抑制HFSC的增值，那么在下一轮的生长期之前应该会减少。为验证这样的假设，研究人员对休止期的三个不同时间点的单细胞数据进一步分析。结果显示，随着休止期过程的发展，CD45+免疫细胞的多样性逐渐减少，从P45的13类减少到P63的3类。且产生OSM的细胞类群由P45到P50时，也变少了，在P63和P80更加减少。这样的结果通过流式细胞计数也得到了验证。对OSM和小胶质细胞markers的轨迹分析也显示，休止期它们的表达持续减少。因此，休止期，TREM2+巨噬细胞通过产生OSM，影响OSMRβ-STAT5信号通路，维持HFSC细胞的静止状态。
图4 不同时间点免疫细胞特征及OSM调控模式图
通过以上分析，该研究不光找到了OSM怎么影响休止期过程，也发现了OSM真正的产生来源是一类TREM2+巨噬细胞。后期，在休止期通过遗传学手段，抗体中和和小分子抑制剂抑制巨噬细胞，发现可以有效诱导生长期过程。
以上是该研究的主要内容及单细胞研究过程中的重点解析。可以看到，该研究通过单细胞转录组实验，一方面解释了OSM到底是由哪一类特定的巨噬细胞产生而来；同时也发现了OSM在休止期三个不同阶段的变化过程，可以说巧妙地将单细胞技术非常完美地利用了起来。因此，单细胞转录组学测序技术，只要能进行合理的设计和规划，相信广大的研究中都可以利用起来。
参考文献：Wang, E.C.E., et al., A Subset
of TREM2(+) Dermal Macrophages Secretes Oncostatin M to Maintain Hair
Follicle Stem Cell Quiescence and Inhibit Hair Growth. Cell Stem Cell,
2019. 24(4): p. 654-669 e6.
