《Cell Stem Cell》巧用单细胞测序解析生发过程的调控机制
单细胞转录组测序是这两年来非常流行的高通量组学研究工具，然而，是不是所有的研究都适合用该方法？是不是所有的问题都可以通过该方法来解释？这是一个值得探讨的问题。从现有的研究报道来说，单细胞转录组学研究很好地解决了细胞图谱，发育过程等重要的生物学问题。但是在相对比较传统的研究方向，是否也能利用单细胞转录组测序方法来使研究更加深入和出色？
本期小编通过对近期发表在《Cell Stem Cell》上的文献的重点内容解析，来领略下生发机制研究中，单细胞转录组学的巧妙运用，如何为解释内在的生发关键时期的调控通路提供了直接证据。
研究背景
哺乳动物毛发生命周期是由毛囊（HF）经历了由生长期（anagen）,退化期（catagen）和休止期（telogen）为代表的三个重要精细调控阶段。来自毛囊干细胞（HFSCs）的角质细胞接受到如Wnt或者Shh等通路的激活信号后，会在生长期促进细胞增殖；在休止期接受到如BMPs等抑制信号时，会促进细胞静止过程。
JAK-STAT通路调控休止期静止的潜在上游调控信号被认为是一些细胞因子家族的因子。制瘤素（OSM）显示出抑制plucking诱导的生长期，而IL-6可以诱导毛囊从生长期进去退化期。OSM和IL-6属于gp130-dependent家族的一类细胞因子，可诱导LIF，CT-1，CNTF的产生。在本研究中，研究人员发现OSM抑制JAK-STAT通路诱导的毛发生长过程，可能是作为一种内源的抑素维持休止期。通过进一步的单细胞测序和验证，发现OSM是由一类TREM2+的巨噬细胞在休止期早期产生来影响毛发生长周期的过程。
图1 研究主要结果展示
研究主体
为研究OSM在毛发生长过程中的调控作用，本研究先进行了一系列的传统分子生物学实验，得到以下几个结论：
1. OSM通过OMSR-JAK-STAT信号通路维持毛囊处于休止期；
2. OSMRβ和其共受体gp130在早期和中期休止期时，在HFSCs细胞凸起与胚芽中，共定位激 活pSTAT5；
3. OSMRb信号通路的干扰缩短了第二个休止期周期；
4. 在休止期中期干扰OMSRβ和STAT5表达促进HFSC的增值和生长期起始；
5. 真皮细胞中的OSM来源于休止期组织中的巨噬细胞；
6. 巨噬细胞产生的OSM在体外能抑制HFSC的增殖；
通过以上的实验，该研究已经打通了OSM影响生发过程中的重要调控过程以及OSM的主要来源问题，应该来说是传统生物分子机制实验的标准操作。但是，该研究没有将结论停留于此，运用单细胞转录组测序手段，该研究继续往前走了一大步。
那么运用单细胞转录组测序，研究人员到底做了些什么，发现了什么呢？
7. 真皮中CD4+免疫细胞进行单细胞转录组测序
研究人员对休止期早（P45）中（P50，P63）晚（P80）三个时期的真皮CD45+免疫细胞进行了单细胞转录组测序（10XGenomics平台）。分析显示，P45时期的细胞共分成13个不同的Cluster。利用已有的巨噬细胞markers CD68，F4/80（Adgre1）和Csf1r，P45期巨噬细胞重新细分到其中的5个不同的cluster中：0，1，2，5，11。而OSM主要是在Cluster11中表达丰度较高。
图2 单细胞测序结果tSNE细胞分类结果
为进行更加精细的分类，研究人员对由巨噬细胞marker表达的细胞进行了重新分类，共产生7个新的分类亚群。这些巨噬细胞簇显示出相对均一的CD68表达，但相对于经典炎症和抗炎标记物是异质的。其中，Cluster 3主要表达抗炎症marker Mrc2(CD206)和CD163，而Cluster 0和1主要表达炎症marker IL-1b和MHC II（H2-Ab1）。值得注意的是，OSM主要局限性地在新分类中的Cluster 6中表达。
8. 产生OSM的巨噬细胞是TREM2+且有着独特的基因表达谱
通过对每个cluster中的显著上调基因进行聚类，可以发现Cluster 6 细胞和“M2-like”的Cluster3表达模式很相似。有意思的是，这两类细胞可以用TREM2 marker区分来开，TREM2特异性地在生产OSM的Cluster 6中表达。
利用在线资源Enrichr对cluster 6的基因分析发现，其功能主要与小神经胶质相关，是中枢神经的长期组织驻留巨噬细胞。小神经胶质细胞相关的marker（Apoe,Aif-1,Cx3cr1和Tmem119）都在该类细胞中由表达。因此，OSM和TREM2是culster 6中特异性高表达的基因。
图3 产生OSM的巨噬细胞的表达特征谱
9. TREM2+巨噬细胞与HFSCs关系密切
研究人员对小鼠真皮组织选取30 μm组织块进行markers免疫荧光检测，发现Aif-1和CD11b与OSM在P45期的毛囊免疫细胞中共定位；TREM2和F4/80与OSM在靠近休止期HFSCs的巨噬细胞中共定位。这部分的结果表明，OSM由处于休止期HFs中的TREM2+巨噬细胞产生。
10. 休止期后TREM2+巨噬细胞会减少
如果TREM2+巨噬细胞抑制HFSC的增值，那么在下一轮的生长期之前应该会减少。为验证这样的假设，研究人员对休止期的三个不同时间点的单细胞数据进一步分析。结果显示，随着休止期过程的发展，CD45+免疫细胞的多样性逐渐减少，从P45的13类减少到P63的3类。且产生OSM的细胞类群由P45到P50时，也变少了，在P63和P80更加减少。这样的结果通过流式细胞计数也得到了验证。对OSM和小胶质细胞markers的轨迹分析也显示，休止期它们的表达持续减少。因此，休止期，TREM2+巨噬细胞通过产生OSM，影响OSMRβ-STAT5信号通路，维持HFSC细胞的静止状态。
图4 不同时间点免疫细胞特征及OSM调控模式图
通过以上分析，该研究不光找到了OSM怎么影响休止期过程，也发现了OSM真正的产生来源是一类TREM2+巨噬细胞。后期，在休止期通过遗传学手段，抗体中和和小分子抑制剂抑制巨噬细胞，发现可以有效诱导生长期过程。
以上是该研究的主要内容及单细胞研究过程中的重点解析。可以看到，该研究通过单细胞转录组实验，一方面解释了OSM到底是由哪一类特定的巨噬细胞产生而来；同时也发现了OSM在休止期三个不同阶段的变化过程，可以说巧妙地将单细胞技术非常完美地利用了起来。因此，单细胞转录组学测序技术，只要能进行合理的设计和规划，相信广大的研究中都可以利用起来。
