中空纤维级联超滤在转基因烟草源性mAb纯化中的应用
简介
转基因烟草是一种新型的单克隆抗体（mAb）表达系统，与传统重组哺乳动物或细菌细胞系相比，其不易受动物源性病原体、毒素或病毒的污染，即更安全，且转基因烟草源性重组蛋白具有与哺乳动物蛋白相似的糖基化模式，构建也相对简单。但转基因烟草表达获得的抗体滴度一般较低，且包含多糖、叶绿素、生物碱、纤维素及天然蛋白等各种可与层析介质非特异性吸附的杂质，导致下游纯化难以高效进行。本实验使用两步级联式中空纤维超滤作为浓缩和预纯化步骤，降低层析操作负载，从而提高纯化工艺的整体效率。
实验 & 结果
实验构建表达抗绿脓假单胞菌抗体的转基因烟草植株，抗体分子量152.6kD。烟叶粉碎后，加入磷酸盐缓冲液均质，纱布过滤去除大粒径植物性杂质，滤液高速连续流离心，获得的上清液用0.2μm CellFlo Plus中空纤维组件（产品编号：C72M-061-01N）微滤去除较小粒径植物成分（平均流速6.4L/m2/h，剪切<800S-1），滤液使用50kD（产品编号：M25S-100-01S，膜表面积：1050cm2）及100kD（产品编号：X2AB-300-02N，膜表面积：145cm2） MiniKros中空纤维组件进行两步级联超滤（流路构建见图，平均流速19L/m2/h，剪切<1800 S-1），将8.4L料液浓缩至0.2L，成功去除~97%的植物源性杂质，并保证mAb的完整回收（~100%），抗体滴度提高达32倍。浓缩液使用50kD组件以磷酸钠缓冲液进行10体积洗滤后，先后进行阳离子交换层析和Protein A亲和层析。获得的纯化mAb进行体积排阻层析、SDS-PAGE及ELISA分析。获得的重组人抗体纯度高于95%，总回收率达50%。
两步级联超滤流路图：M1-50kD中空纤维组件；M2-100kD中空纤维组件；Pf-Cole-Parmer Masterflex进样泵；Pp-Thomas Welch vacuum滤液泵；Pr-Cole-Parmer ISMATEC回流泵；PD-脉冲阻尼器，用于稳定系统内液流；系统同时监测各组件入口及滤液压力，并在不同位置设置分流阀。
讨论
结果显示，使用50及100kD中空纤维组件进行两步级联浓缩-洗滤，可显著降低料液杂质含量，并提高产物浓缩，减轻后续层析步骤负载。与PEG/PEI沉淀法相比，该技术不会引入额外的添加剂，且选择性高；与直接层析法相比，预过滤提高了层析进样的纯度和浓度，有助于优化层析设备的利用率，降低成本。该方法温和且易于工艺放大，适用于烟草源性抗体的大规模纯化。
