中空纤维膜过滤技术在病毒类疫苗中的应用（三）
3.中空纤维浓缩病毒培养液实例
相对于其他杂蛋白和DNA等杂质，病毒颗粒具有较大的分子量，因而可以使用超滤膜过滤和分子筛等技术按照分子量大小进行分离分级，建立通用的病毒纯化工艺。病毒类疫苗通常使用微载体细胞培养技术进行病毒培养，一定滴度的病毒培养收获液通过 1-2um玻璃纤维GF澄清过滤去除细胞碎片和部分 DNA，超滤膜浓缩 10-80倍，经灭活水解之后使用 Sepharose 4FF或 6FF分子筛层析按照分子量大小进行精细纯化[16] 。
图 3 通用的病毒疫苗生产工艺
病毒超滤浓缩通常使用 100-300k膜包，膜包筛网剪切力易造成病毒颗粒聚集和表面蛋白的脱落，从而影响病毒活性收率，因此对操作要求极高；此外，膜包筛网剪切力还容易加速杂蛋白的聚集（如牛血清白蛋白，卵清蛋白等），而100-300k较小的膜包孔径不利于浓缩过程中杂蛋白透过，因此浓缩液杂蛋白含量在浓缩过程中不断增加，蛋白凝胶层显著影响浓缩处理速度，较高的黏度也不利于后期4FF分离纯化和填料寿命。
3.1 狂犬病毒培养液的浓缩
狂犬病毒属于弹状病毒科，病毒包膜的次突上的糖蛋白G是唯一暴露于病毒外部的病毒蛋白，是诱发细胞与体液免疫的主要抗原物质[17] 。超滤浓缩过程中需要尽量温和以避免G蛋白的脱落，保护病毒的免疫原性，同时尽可能去除杂蛋白和 DNA片断。
3.1.1 实验条件
样品：澄清病毒收获液 (CTN株，Vero细胞 Cytodex 1微载体连续 培养，Lot20090401)
实验设备：Quixstand 中空纤维卫生级超滤系统（可整体高压灭菌）
AKTA Purifier10 层析仪
中空纤维超滤柱：UFP-750-E-4x2MA_0.085m2 (750kDa MWCO，GE)
Cassette 300k膜包0.1m2（某进口品牌）
检测方法：LD50病毒滴度(药典2010)，Elisa，Sepharose 4FF 16/40分析柱，目测外观
3.1.2 实验结果
我们分别使用中空纤维 750k超滤柱(GE)和 300k超滤膜包(某进口品牌) 进行狂犬病毒收获液的浓缩，考察处理速度、病毒颗粒收率和浓缩液澄清度等指标。除病毒滴度外，浓缩液使用Sephorase 4FF 16/40分子筛分析柱进行分析，快速检测比较杂质残留。
表1狂犬病毒培养液超滤浓缩实验条件 
* 指开始滤洗时的浓缩倍数
使用 750k中空纤维和 300k膜包浓缩过程的通量-透过体积曲线见下图(Flux-Permeate Vol)。使用中空纤维 750k超滤柱进行狂犬病毒培养液浓缩，浓缩 20倍然后滤洗 3倍，整个过程需要 1小时 16分，平均处理通量 61 L/m2/hr (LMH)。使用膜包300k进行浓缩，浓缩20倍然后滤洗3倍，整个过程历时 1小时 20分，平均处理通量 49 LMH。
