中空纤维膜过滤技术在病毒类疫苗中的应用（二）
2.中空纤维膜过滤技术
2.1中空纤维膜过滤原理简介
中空纤维膜过滤技术属于切向流过滤技术（Tangential Flow Filtration, TFF）的范畴，又称错流过滤（Cross-Flow Filtration，CFF），其操作原理如图1：料液以一定的流速在膜的上表面循环，小于膜孔径的物质可以透过膜到透过端，而大于膜孔径的物质会被膜截留，从而实现目标物质的浓缩以及不同物质的分级分离[8] 。
和传统的平板膜包相比，中空纤维膜具有纤维管状的开放式流道结构(图 2)，无筛网的管状流道结构避免了料液的无规则剧烈湍流，因此具有更低的剪切力，温和的操作可以有效防止病毒表面糖蛋白的脱落和蛋白的聚集，有利于保护大分子病毒的完整性，防止病毒颗粒聚集的同时有助于杂蛋白的透过和去除。
中空纤维膜按孔径分为超滤膜和微滤膜，孔径齐全：超滤中空纤维膜(如750k)常用于蛋白质或病毒颗粒温和快速的浓缩；而微滤中空纤维膜( 如 0.45µm, 0.65um )可以直接用于培养液中细胞和细胞碎片的去除，实现层析柱前料液的澄清，省去离心过滤等预处理步骤。中空纤维膜具有良好的物理化学耐受性，超滤中空纤维膜入口耐压大于4bar，可以在50度下耐受1M NaOH/300ppm NaClO进行彻底清洗，大多数中空纤维膜还可以高压灭菌，寿命长，成本低[9] 。
2.2 中空纤维膜过滤技术在病毒疫苗中的应用
中空纤维膜开放式流道解决了病毒颗粒浓缩时易堵膜和对剪切力敏感易聚集两大技术难题，提供了较温和的超滤方法以有效保护病毒颗粒的完整性，因此广泛应用于疫苗等生物制药和生命科学研究领域[10] 。
中空纤维750k超滤膜采用先进的膜加工制造工艺，具有均一的孔径分布，有效截留病毒的同时避免病毒在膜上的沉积，速度快收率高，同时较大的孔径使得DNA和杂蛋白等杂质透过而加以去除，降低浓缩后的料液黏度，提高产品质量[16] 。
美国默克公司将中空纤维过滤膜用于多种疫苗的生产，如使用300k中空纤维膜进行重组酵母乙肝疫苗的浓缩和洗滤，使用0.65µm 中空纤维膜澄清酵母裂解液生产HPV疫苗等[11]。 Bernd Kalbfuss 等人将750k中空纤维膜用于MDCK细胞流感病毒培养液的浓缩，发现中空纤维750k超滤膜可以有效去除宿主DNA等杂质[12,13] 。C. Peixoto 等使用中空纤维750k浓缩轮状病毒的昆虫细胞培养液，优化后的浓缩收率达86%，浓缩的同时去除97%的DNA。最终得到高纯度的轮状病毒VLP类病毒颗粒, 工艺总收率37% [14] 。
中空纤维化学稳定性极佳，寿命长，单位膜面积成本低，也广泛用于口蹄疫、狂犬等兽用病毒类疫苗的浓缩，改善产品质量。吕洪亮等在2009年成功的使用750k中空纤维进行兽用狂犬疫苗的浓缩，研究结果表明：相比100k和500k的超滤膜，750k中空纤维膜可以充分截留狂犬病毒，实现高抗原收率，同时有效去除牛血清白蛋白，提高疫苗的安全性、有效性和稳定性。最终成功建立了Cytodex 1微载体细胞培养、中空纤维750k浓缩、Sepharose 6FF层析纯化的高质量兽用狂犬疫苗生产新工艺 [15] 。目前采用此工艺的纯化兽用灭活狂犬疫苗已经获得新兽药证书正式投产。
