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菌落PCR（Colony PCR）具体方法

2020.9.01

菌落PCR（Colony PCR）可不必提取基因组DNA，不必酶切鉴定，而是直接以菌体热解后暴露的DNA为模板进行PCR扩增，省时少力。建议使用载体上的通用引物。通常利用此方法进行重组体的筛选或者DNA测序分析。最后的PCR产物大小是载体通用引物之间的插入片断大小。

具体方法：

1、PCR混合物的制备

Taq buffer（10×） 20 ul

dNTP（2.5 mM） 5 ul

Primer Forward（50 mM） 10 ul

Primer Reverse（50 mM） 10 ul

ddH2O 147 ul

Taq（2U/ul） 8 ul

total 200 ul

将上述溶液混匀，10 ul每管分装于200 ul PCR管中。

2、常温下随机挑选转化板上的转化子，用灭菌的牙签或枪头挑取少量菌体，在LB琼脂糖平板上轻点，做一拷贝；然后将沾有菌体的牙签或枪头置于相应的装有PCR混合物的PCR管中洗涤数下（管子做好记号，如平板上点的是1＃，则管子上也标1＃，以便筛选到克隆后的扩到培养），盖紧管子。

3、将混有菌体的PCR混合物置于PCR仪中，按常规条件扩增。电泳检测是否得到目的片断。如有则为阳性克隆。

4、将已经接种有菌落的平板置 37℃培养箱培养过夜，使菌落扩增；次日挑选阳性克隆做进一步筛选或培养。步骤2也可以不点板，直接接种摇菌，如果早上做PCR的话，下午就可以提质粒，得到重组载体。

注意事项：设计引物很关键。一般如果是定向克隆，用载体上的通用引物即可；如pET系列可用T7通用引物。如果是非定向克隆（如单酶切或平末端连接），一条引物用载体，一条引物用目的基因上的，这样就可以比较方便的鉴定了，而且错误概率很低。PCR条件的选择接近最佳，同时挑取的菌体不宜太多，否则会有非特异性扩增。

Colony PCR

Amplify SSLP marker (CER 454202) from 51MO5 Agro streaks.

E. coli 51M5 streak used as positive control.

Agro and E. coli streak of 79E22 used as negative control.

1. Mix 10 µl NEB Taq buffer + 90 µl H2O. Aliquot 10 µl of the mix into PCR tubes. Label with the sample name. Touch each streak with toothpick and transfer cells to the buffer in the PCR tubes.

2. Prepare PCR mix on ice:
_________________________________________________________

For each sample you need For 8 sample mix
___________________________________________________________________

17 µlH2O 17 µl H2O

4 µl NEB Taq buffer 32 µl NEB Taq buffer

5 µl 2.5 mM dNTPs 40 µl mM dNTPs

7 µl CER454202 Fprime (3 µM) 56 µl CER454202 Fprime (3 µM)*

7 µl CER454202 Rprime (3 µM) 56 µl CER454202 Rprime (3 µM)**

0.2 µl Taq polymerase (NEB) 1.6 µl Taq polymerase (NEB)

___________________________________________________________________

Add 38 µl of the mix to each PCR tube and mix gently by pipetting.

3. Run PCR: 95℃ 5 min

95℃ 30 sec, 52℃ 30 sec, 72℃ 1 min, 40 cycles

72℃ 10 min

*2.1 µl CER454202 Fprime (3 µM) 16.8 µl CER454202 Fprime (3 µM)

**2.1 µl CER454202 Rprime (3 µM) 16.8 µl CER454202 Rprime (3 µM)

菌落pcr

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