高效液相色谱法检测食用组织和牛奶中氮杂菲残留量
高效液相色谱法检测食用组织和牛奶中氮杂菲残留量
一、原理
用乙腈、甲酸铵、甲醇溶液萃取，正己烷脱脂，高效液相色谱-串联质谱法测定，外标法测定。
二、试剂和材料
除另有规定外所有试剂均为分析纯水为GB/T 6682规定的一级水。
2.1 试剂
2.1.1用层析法纯化甲醇(CH3OH)。
2.1.2乙腈（CH3CN）：色谱纯。
2.1.3甲酸（HCOOH）：色谱是纯的。
2.1.4正己烷（C6H14）。
2.1.5无水硫酸钠(Na2SO4)。
2.1.6甲酸铵（HCOONH4）。
2.2 溶液配制
2.2.10.25mol/L甲酸铵-甲醇溶液：甲酸铵15.8g溶于甲醇稀释至1000 mL。
2.2.2 0.1%甲酸溶液：取1.0ml甲酸用水溶解稀释至1000ml。
2.2.3 80%甲醇溶液：甲醇400 mL溶于水稀释至500 mL。
2.2.4提取液：取乙腈和0.25mol/L甲酸铵甲醇溶液按1:1（体积比）混合。
2.3标准品：氨酚盐酸含量为95.0%。
2.4 标准溶液的制备
2.4.1标准储备液：取硝苯地平标准品10mg，精密称取，溶于10ml棕色容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，制备浓度为1mg/ml的标准储备液。-存储在20℃以下。
2.4.2氮杂菲定标准工作液10μg/ml：精密量取标准储备液100μl，用甲醇溶解于10ml量瓶中，稀释至刻度，制备氮杂菲定标准工作液10μg/ml。-存储在20℃以下。
2.4.3 100 ng/ml氮杂菲标准工作液：精密量取1 ml 10μg/l氮杂菲标准工作液，用80%甲醇溶解于100 ml量瓶中，稀释至刻度，制备浓度为100 ng/ml的氮杂菲标准工作液。（2）储存于8℃。
2.5 材料：滤膜：0.22 µm。
三、仪器和设备
3.1高效液相色谱串联质谱仪分布喷雾离子源。
3.2分析平衡：灵敏度0.000 g和0.01g。
3.3 漩涡振荡器。
3.4 振荡器。
3.5 组织匀浆机。
3.6 冷冻离心机。
3.7 旋转蒸发仪。
3.8 鸡心瓶：50 mL。
3.9 离心管：50 mL。
四、测定步骤
4.1提取：称取供试品5g（精确至±20mg），置50ml离心管中，加入2g无水硫酸钠，加入10ml提取液，混匀，振摇5min，6000 r/min离心10min，取上层溶液于鸡心瓶中。用10 mL的提取液，在鸡心瓶中加入两次提取液，在45℃水浴中蒸发干燥。
4.2纯化方法：在鸡心脏瓶中加入2 mL 80%甲醇溶液，完全旋涡溶解残渣，加入2 mL正己烷混合1 min，转入10 mL离心管，离心6 000 r/min，离心5 min，丢弃上层正己烷液。加入2毫升正己烷，重复提取。低液过滤后用于高效液相色谱(HPLC)-串联质谱(MS)。
4.3 基质匹配标准曲线的制备
准确量取100 ng/ml氮杂菲标准工作液或10μg/ml氮杂菲标准工作液，用80%甲醇溶液在提取蒸干的空白试样残渣中溶解并稀释至2.0 ml，使氮杂菲浓度为20，50、100、200、500、1000 ng/ml，过滤，制成一系列基质匹配的高效液相色谱标准工作液仪器-串联质谱仪以特征离子峰面积为纵向坐标，以相应的标准溶液浓度为横向坐标，绘制标准曲线。找出回归方程和相关系数。
4.4 测定
4.4.1 高效液相色谱仪条件
a色谱柱： BEH C 18 （100 mm×2.1 mm，1.7 µm） 或相当者；
b柱温：30℃；
c流速：0.2 mL/min；
d进样量：10 µL；
e流动相：A+B=50+50，其中A相为乙腈（含0.1%甲酸）B相为水（含0.1%甲酸）。
4.4.2 质谱条件
a电离模式： ESI；
b扫描方式：正离子扫描；
c检测方式：多反应检测；
d电离电压：2.8 kV；
e源温：110℃；
f雾化温度：350℃；
g锥孔气流速：50 L/h；
h雾化气流速：550 L/h；
i驻留时间：0.3s；
J定性、定量离子以及相应的锥孔和碰撞电压如表1所示.
4.4.3 测定法
取供单点或多点校准用的样品溶液及相应的基体匹配标准溶液，按外标法计算样品溶液中基质匹配的标准溶液和硝基菲的反应应在仪器检测的线性范围内样品溶液中离子的相对丰度与基体匹配标准溶液中离子的相对丰度的规定在上述高效液相色谱-质谱中，在附录A中显示了氮-氨-菲基质匹配标准溶液的特征离子质谱图。
五、结果计算和表述
试料中氮氨菲啶的残留量按式（1）计算：
式中:
X供试品中氮杂菲的残留量，单位为微克/千克（g/kg）
(A)以纳克/毫升为单位的Cs-基质匹配标准溶液中的氮虫灵浓度；
基质匹配标准溶液中氮杂菲定的s峰面积；
A 试样溶液中氮氨菲啶的峰面积；
用于溶解残余物的溶液的体积，单位为ml(ml)；
m 供试试料质量，单位为克（g）。
