新的PPR蛋白dek2影响线粒体内含子1的剪切和线粒体功能...
新的PPR蛋白dek2影响线粒体内含子1的剪切和线粒体功能以及玉米籽粒的发育
2017年1月1日遗传学期刊Genetics（影响因子4.6）在线发表了上海大学生命科学学院祁巍巍老师的有关玉米突变体基因克隆与功能分析新文章，题为：Mitochondrial function and maize kernel development requires Dek2, a pentatricopeptide repeat protein involved in nad1 mRNA splicing。
在开花类的植物中，很多和呼吸相关的蛋白都是受到了线粒体基因组编码基因以及细胞核编码基因协同调控。三角状五肽重复区(Pentatricopeptide repeat，PPR) 蛋白已经有报道其参与了RNA与蛋白质之间的相互作用。玉米籽粒突变体defective kernel 2 (dek2) 是一个典型的小籽粒以及发育迟缓的突变体。图位克隆以及等位测试确认dek2编码了一个新的线粒体中的P-type PPR蛋白。线粒体转录本分析表明dek2突变体引起了线粒体内nad1内含子1的剪切效率下降。dek2未成熟籽粒线粒体复合物分析表明复合物1显著缺失。转录组测序与透射电镜观察发现，由于AOXs蛋白的高表达，nad1适当的剪切对线粒体功能以及线粒体的内嵴至关重要。在该研究中，研究人员发现dek2是一个新的PPR蛋白，其影响线粒体nad1内含子1的剪切并且对于线粒体功能以及籽粒发育至关重要。
研究思路
研究结果
dek2影响籽粒正常发育
研究人员从玉米种质中心获取dek2的突变体并且对其与W22杂交，使其背景纯化，以利于表型观察。在对其表观以及细胞层面上的观察发现，dek2的突变体籽粒和野生型相比，显著变小，百粒重只有野生型32%，总蛋白含量下降4%，醇溶蛋白下降21%，非醇溶蛋白含量上升38%，淀粉粒体积显著减小，并且籽粒胚乳糊粉层发育受到显著抑制（图1，2）。
dek2的图位克隆
为了对dek2进行基因定位，研究人员使用了图位克隆的方法。经过对438粒突变体籽粒的初定位以及3358粒籽粒的精细定位发现，GRMZM2G110851的单碱基SNP导致了该表型的产生（图3）。
dek2编码了一个P-type PPR蛋白
GRMZM2G110851在基因组上含有1893个碱基长度并且编码了一个630个氨基酸的蛋白（图3）。BLASTP的比对发现该基因编码了一个P-type PPR蛋白，包含了10个PPR重复序列（图3）。在第914位碱基G-A的突变导致了Gly-Glu的变化，从而产生了突变体表型。该结果同时被UniformMu转座子突变的等位测试确认（图3）。
dek2是一个保守的线粒体定位蛋白
PPR蛋白在植物中广泛存在。研究人员为了确认dek2的进化地位，构建了dek2全长蛋白序列的进化树。结果表明，dek2同源基因广泛存在于被子植物中，而在玉米中没有同源基因（图4）。对dek2的共聚焦显微镜亚细胞定位研究发现，dek2与线粒体marker存在共定位，即dek2定位于线粒体内嵴。
dek2影响nad1内含子1的剪切
由于PPR蛋白可以与对应的线粒体或者叶绿体RNA互作，因此研究人员对18DAP dek2突变体胚乳以及野生型胚乳的线粒体转录本进行了分析。研究人员使用特异的引物扩增了线粒体cDNA，在35个基因中，只有nad1的成熟转录本在dek2中显著下降（图5）。进一步研究发现，nad1内含子1在dek2中显著下降导致了全长成熟转录本表达量下降。
dek2影响了线粒体复合物I的聚集
为了深入研究线粒体的呼吸复合物，研究人员奋力了dek2 18DAP线粒体蛋白并且进行了非变性的BN-PAGE电泳。电泳结果显示，复合物I含量显著下降（图6）。该结果证明了nad1内含子1的剪切影响导致了复合物I功能的下降。
dek2影响了线粒体的正常功能
研究人员为了对dek2在籽粒发育过程中的作用有全局性的了解，分别选取了18DAP的dek2胚乳以及野生型胚乳进行了RNA转录组测序（RNA-Seq服务由上海伯豪提供）。经过数据分析，一共筛选到了2065个差异基因，其中1095个基因具有功能注释。在GO归类后，研究人员发现，这些基因主要聚集于GO: 004429 455 (Mitochondrial part, p-value=8.43E-13); GO: 0003942 (GTPase activity, 456 p-value=3.08E-08); GO: 0006119 (Oxidative phosphorylation, 457 p-value=0.000853); and GO: 0006626 (Protein targeting to mitochondrion, 458 p-value= 0.00488) 。其中，包含了一个维持TCA循环稳定的Aox2基因。该基因在dek2中表达量上升1162倍。
原文出处：Qi W,Yang Y,Feng X,Zhang M,Song R.Mitochondrial Function and Maize Kernel Development Requires Dek2, a Pentatricopeptide Repeat Protein Involved in nad1 mRNA Splicing.Genetics. 2017
作者简介
祁巍巍，女，复旦大学博士。2014年加入上海大学生命科学学院从事玉米籽粒突变体的克隆与功能分析。多次于Plant Cell，Plant Physiology，PLOS Genetics，Genetics以及BMC Biotechnology上发表研究性论文。工作内容主要聚焦于玉米籽粒突变体的克隆与功能研究，CRISPR/Cas9系统在玉米中的作用等方向。其工作原创性高，大大拓展了人们在玉米籽粒遗传学领域的认识，对玉米的分子机制研究做出了突出贡献。
