条件恐惧实验对于小鼠认知功能和线粒体功能的影响
【摘要】
目的观察条件恐惧实验对于小鼠认知功能和线粒体功能的影响。方法成年雄性C57BL／6小鼠60只随机分为四组：假手术+生理盐水组(SN组，”一10)、假手术+SS
31组(ss组，n—lo)、盲肠结扎穿孔(CLP)+生理盐水组(CN组，”一20)和CLP+SS31组(cs组，”一20)。术毕每天腹腔注射5
rag／kg SS 31(ss、CS组)或等容生理盐水(SN、CN组)，连续6
d。术后第7、8天，行条件恐惧实验；行为学测试后处死小鼠，取海马组织检测活性氧自由基(ROS)及三磷酸腺苷(ATP)水平，提取线粒体检测线粒体电子传递链复合物工、T『、『『『、Ⅳ酶活性及线粒体膜电位(MMP)水平。结果与CN组比较，SN、SS和CS组24
h场景实验僵直时间明显增加(P<0．05)，ROS水平明显降低，ATP、MMP及复合物工和仃『酶活性明显升高(Pd0．05)。与CS组比较，SN和SS组ROS水平明显降低，人TP、MMP及复合物I和m酶活性明显升高(P<0．05)。结论线粒体抗氧化肽$531可改善脓毒性脑病小鼠认知功能，其机制可能与减轻线粒体损伤有关。
【关键词】 脓毒症；认知；线粒体；抗氧化剂；小鼠
脓毒性脑病(sepsis associated encephalopathy，SAE)表现为长期的自主神经功能紊乱、谵妄和认知功能障碍，其确切机制尚不清楚，且缺少有效治疗措施。研究表明线粒体功能紊乱在脓毒症多器官功能障碍发生发展中起重要作用，推测线粒体功能紊乱可能是SAE病理生理学机制之一。线粒体抗氧化肽SS 31可清除线粒体内活性氧自由基(reactiveoxygen species，ROS)及增加三磷酸腺苷(adenosine 5’triphosphate，ATP)水平，具有明显的线粒体保护作用。本研究观察SS 31对SAE小鼠认知功能及线粒体功能的影响，为SAE的防治提供参考。
材料与方法
动物选择与分组成年雄性C57BL／6小鼠60只，由南京军区南京总医院比较医学科提供，体重20～28 g。随机分为四组：假手术+生理盐水组(SN组，n 10)、假手术+SS-31组(ss组，咒一lo)、CLP+生理盐水组(CN组，n 20)和CLP+SS31组(cs组，n 20)。CN组和CS组采用盲肠结扎穿孔法(CLP)建立SAE模型，SN组和SS组仅做剖腹、分离盲肠远端、关腹手术。术毕连续6 d，每天分别腹腔注射5mg／kg SS-÷31(SS和CS组，上海强耀生物科技有限公司)和等容生理盐水(SN和CN组)。CLP模型建立术前禁食12 h，戊巴比妥钠(40mg／kg，Sigma公司)腹腔注射麻醉，腹正中线做1 cm长的切口，游离肠系膜和盲肠，近盲肠根部1．2 CIll处以4-0丝线环形结扎，22号针头于结扎端贯通穿刺两次，挤出粪便少许，还纳肠段，依次缝合腹膜和皮肤，所有操作均于8 min内完成。
行为学测试
术后第7天存活小鼠参照文献进行条件性恐惧实验。将小鼠置于75％酒精擦拭的实验盒中探索180 S，随后给予声音刺激(80dB，3600 Hz)60 S，紧接着给予足部电刺激(0．75mA，1 s)，小鼠继续适应180 S后取回。分别于训练后2 h及24 h进行场景和声音实验，其中场景实验主要反映海马依赖性记忆，声音实验主要反映非海马依赖性记。V,E8I。场景实验将小鼠放入相同的环中390 S，记录第2个180 S内僵直时间。声音实验将小鼠放不同的环境中390 S，第2个180 S时给予相同声音刺激而无电击，记录僵直时问。实验时采用条件恐惧实验系统(北京众实迪创)自动记录小鼠在电击箱内的活动状态。每次实验结束后，用75％的酒精擦洗底座，避免气味对实验的干扰。ROS和ATP水平检测 行为学测试后各组取5只小鼠处死，取新鲜海马组织匀浆，参照ROS试剂盒(fin海杰美基因医药科技有限公司)和ATP试剂盒(fin海碧云天生物技术有限公司)说明书步骤检测ROS和ATP水平。复合物I、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ酶活性和线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential，MMP)检测行为学测试后各组取5只小鼠处死取新鲜海马组织，参照线粒体提取试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)说明书步骤提取并纯化线粒体。复合物工、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ酶活性和MMP水平参照线粒体呼吸链复合物活性检测试剂盒和纯化线粒体膜电位荧光测定试剂盒(上海杰美基因医药科技有限公司)说明书步骤进行操作。
统计分析
采用SPSS 17．o软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差(i±s)表示，组问比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK法。
结 果
条件性恐惧实验本研究中，CN组与CS组小鼠死亡数分别为9只和6只，差异无统计学意义，SN组与SS组小鼠未见死亡，存活小鼠完成条件性恐惧实验。与CN组比较，SN、SS和CS组24 h场景实验僵直时间明显增加(P
ROS、ATP和MMP水平变化 与CN组比较，SN、SS和CS组ROS水平明显降低(P复合物工、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ酶活性 与CN组比较，SN、SS和CS组复合物工和Ⅲ活性明显升高(P<0．05)；与CS组比较，SN和SS组复合物I和Ⅲ活性明显升高(P<0．05)。
讨 论
本研究观察到CLP小鼠术后8 d时24 h场景实验僵直时问明显减少，表现为海马依赖性的认知功能损伤，并伴随海马组织中ROS水平升高，ATP水平降低，以及线粒体中复合物工、Ⅲ酶活性和MMP水平的降低，我们推测线粒体电子传递链功能损伤引起ROS水平增加和ATP水平降低是脓毒症线粒体功能紊乱及SAE认知功能障碍的发病机制之一。
脓毒症时，不同组织线粒体电子传递链损伤不尽相同。Comim等观察到CLP大鼠24、48和96h时小脑、海马、纹状体和脑皮质线粒体复合物工酶活性明显降低，复合物Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ酶活性未见明显改变，而d’Avila等观察到CLP大鼠24 h时脑组织复合物Ⅳ活性明显降低。此外，Peruchi等E113观察到CLP大鼠骨骼肌组织中复合物Ⅱ、Ⅲ酶活性12 h时降低，48 h时所有复合物活性均降低。Zapelini等则观察到肝组织中复合物Ⅳ活性3～48 h时降低。而在本研究中，我们观察到CLP小鼠8 d时，大脑海马组织中复合物工和Ⅲ酶活性明显降低，复合物Ⅱ和Ⅳ酶活性无明显改变，这一变化可能与CLP的时问及组织不同有关。线粒体电子传递链复合物酶活性及MMP是线粒体功能的重要参数，其中复合物工和Ⅲ是细胞内ROS产生的主要部位，其活性降低可引起ROS明显增加。而MMP是ATP形成的先决条件，在电子传递的过程中，质子可通过复合物工和Ⅲ逆浓度梯度进入线粒体膜外形成线MMP，并经过ATP合酶顺浓度梯度进入线粒体产生ATP，所以复合物工和Ⅲ酶活性降低可引起MMP降低，进而引起ATP产生的减少。故本研究中CLP引起小鼠海马线粒体功能紊乱，主要表现为线粒体复合物工和Ⅲ酶活性和MMP水平降低且伴随ROS水平增加以及ATP水平的降低。
线粒体抗氧化肽SS-31可自由通过血脑屏障和细胞膜，在线粒体内膜浓度为线粒体外浓度1 000倍以上，且不依赖于线粒体膜电位。SS 31可清除细胞内各种ROS如过氧化氢(H。O。)、超氧阴离子(OF)及羟自由基(·OH)等，具有增加ATP的产生及稳定线粒体膜电位等作用，在神经退行陛疾病、代谢性疾病以及缺血一再灌注损伤等疾病中发挥重要保护作用。本研究我们观察到SAE小鼠模型中连续给予SS-31可使24 h场景实验僵直时间增加，改善小鼠认知功能，并减少海马组织中ROS水平，增加ATP和MMP水平，以及抑制复合物工和Ⅲ酶活性的降低，具有明显的线粒体保护作用。
综上所述，线粒体功能紊乱可能是SAE认知功能障碍的病理生理学机制之一，连续给予线粒体抗氧化肽SS 31可改善脓毒性脑病小鼠的认知功能，其作用可能与保护线粒体功能有关。
