聚合酶链式反应(PCR)扩增和扩增产物克隆(三)
材料、设备及试剂
一、材料
不同来源的模板DNA。
二、设备
移液器及吸头,硅烷化的PCR小管,DNA扩增仪(PE公司),琼脂糖凝胶电泳所需设备(电泳槽及电泳仪),台式高速离心机。
三、试剂:
1、10×PCR反应缓冲液:500mmol/L KCl, 100mmol/L Tris·Cl, 在25℃下, pH9.0, 1.0% Triton X-100。
2、MgCl2 :25mmol/L。
3、4种dNTP混合物:每种2.5mmol/L。
4、Taq DNA聚合酶5U/μl。
5、T4 DNA连接酶及连接缓冲液。
6、经SmaⅠ酶切和加dT的pUC质粒。
7、其它试剂:矿物油(石蜡油),1% 琼脂糖,5×TBE,酚:氯仿:异戊醇(25:24:1),无水乙醇和70% 乙醇。
操作步骤
一、PCR反应
1、 依次混匀下列试剂
35μl H2 O
5μl 10×PCR反应缓冲液
4μl 25mmol/L MgCl2
4μl 4种dNTP
0.5μl 上游引物(引物1)
0.5μl 下游引物(引物2)
0.5μl 模板DNA(约1ng)
混匀后离心5秒。
2、将混合物在94℃下加热5分钟后冰冷,迅速离心数秒, 使管壁上液滴沉至管底,加入Taq DNA聚合酶(0.5μl约2.5U),混匀后稍离心,加入一滴矿物油覆盖于反应混合物上。
3、 用94℃变性1分钟,45℃退火1分钟, 72℃延伸2分钟, 循环35轮,进行PCR。最后一轮循环结束后, 于72℃下保温10分钟,使反应产物扩增充分。
二、电泳
取10μl扩增产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳分析,检查反应产物及长度。
三、PCR产物的纯化
扩增的PCR产物如利用T-Vector进行克隆,可直接使用,如用平未端或粘性未端连接,往往需要将产物纯化。
(一)酚/氯仿法
1、取反应产物加100μl TE.。
2、加等体积氯仿混匀后用微型离心机10000rpm离心15秒,用移液器将上层水相吸至新的小管中. 这样抽提一次, 可除去覆盖在表面的矿物油。
3、再用酚:氯仿:异戊醇抽提二次,每次回收上层水相。
4、在水相中加300μl 95%乙醇,置-20℃下30min沉淀。
5、在小离心机上10000rpm离心10min,吸净上清液。加入1ml 70%乙醇,稍离后,吸净上清液.重复洗涤沉淀2次。将沉淀溶于7ml ddH2O 中,待用。
(二)Wizard PCR DNA纯化系统
Wizard PCR DNA纯化系统可以快速、有效、可靠地提取PCR扩增液中的DNA,提纯后的DNA可用于测序、标记、克隆等。 该系统中含有的试剂和柱子可供50次PCR产物的纯化,试剂包括:
50ml Wizard PCR DNA纯化树脂
5ml 直接提取缓冲液
50支 Wizard微型柱
1、吸取PCR反应液水相放于1.5ml eppendorf管中。
2、加100ml直接提取缓冲液,涡旋混匀。
3、加1ml PCR DNA纯化树脂,1分钟内涡旋混合3次。
4、取一次性注射器, 取出注塞,并使注射筒与Wizard微型柱连接,用移液枪将上述混合液加入注射筒中,并用注塞轻推,使混合物进入微型柱。
5、将注射器与微型柱分开,取出注塞, 再将注射筒与微型柱相连,加入2ml 80%异丙醇,对微型柱进行清洗。
6、取出微型柱置于eppendorf管中,12000g离心20秒,以除去微型柱中的洗液。
7、将微型柱放在一个新eppendorf管中,加50μl TE或水,静止1分钟后,12000g离心20秒。
8、丢弃微型柱,eppendorf管中的溶液即为纯化DNA,存放于4℃或-20℃。
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技术原理