荧光定量PCR实验指南-3
3.3 引物、探针的纯度和稳定性
定制引物的标准纯度对于大多数PCR应用是足够的。部分应用需要纯化，以除去在合成过程中的任何非全长序列。这些截断序列的产生是因为DNA合成化学的效率不是100％。这是个循环过程，在每个碱基加入时使用重复化学反应，使DNA从3'到5'合成。在任何一个循环都可能失败。较长的引物，尤其是大于50个碱基，截断序列的比例很大，可能需要纯化。
引物产量受合成化学的效率及纯化方法的影响。定制引物以干粉形式运输。最好在TE重溶引物，使其最终浓度为100μM。也可以用双蒸水溶解。
引物的稳定性依赖于储存条件。应将干粉和溶解的引物储存在-20℃。以大于10μM浓度溶于TE的引物在-20℃可以稳定保存6个月，但在室温（15℃到30℃）仅能保存不到1周。干粉引物可以在-20℃保存至少1年，在室温（15℃到30℃）最多可以保存2个月。
探针即寡核苷酸进行荧光基团的标记，标记本身有效率的区别。探针标记以后一般应该纯化，纯度高、标记效率高的探针不仅荧光值高，且保存时间可以高达一年以上。不同的生物技术公司探针标记效率和纯度有很大的区别。
由于反复冻融易导致探针降解，在确认探针质量好的情况下，最好稀释成2uM（10×），作为工作浓度分装多支，避光保存。
3.4 热启动
热启动PCR是除了好的引物设计之外，提高PCR特异性最重要的方法之一。尽管Taq
DNA聚合酶的最佳延伸温度在72℃，聚合酶在室温仍然有活性。因此，在进行PCR反应配制过程中，以及在热循环刚开始，保温温度低于退火温度时会产生非特异性的产物。这些非特异性产物一旦形成，就会被有效扩增。在用于引物设计的位点因为遗传元件的定位而受限时，如定点突变、表达克隆或用于DNA工程的遗传元件的构建和操作，热启动PCR尤为有效。
限制Taq DNA聚合酶活性的常用方法是在冰上配制PCR反应液，并将其置于预热的PCR仪。这种方法简单便宜，但并不能完全抑制酶的活性，因此并不能完全消除非特异性产物的扩增。
热启动通过抑制一种基本成分延迟DNA合成，直到PCR仪达到变性温度。包括延缓加入Taq
DNA聚合酶在内的大部分手工热启动方法十分烦琐，尤其是对高通量应用。其他的热启动方法使用蜡防护层将一种基本成分，如镁离子或酶，包裹起来，或者将反应成分，如模板和缓冲液，物理地隔离开。在热循环时，因蜡熔化而把各种成分释放出来并混合在一起。象手动热启动方法一样，蜡防护层法比较烦琐，易于污染，不适用于于高通量应用。
Transitor®HotStartTaq酶对于自动热启动PCR来说高效可靠。
Transitor®HotStartTaq是在常规Taq酶的基础上进行了化学修饰，使得该酶在低温或常温下没有酶活，因此在加样至PCR扩增前，不会产生由于引物随机粘连而形成的非特异性扩增。高温条件下，化学修饰集团会被剪切，从而释放酶活。此外，随着PCR扩增的进行，酶活会被逐步释放，有效提高扩增效率及产物量。Transitor®HotStartTaqDNA聚合酶在变性步骤的95℃保温过程中要持续20分钟才会被释放到反应中，从而完全恢复聚合酶活性。
3.5镁离子浓度
镁离子影响PCR的多个方面，如DNA聚合酶的活性，这会影响产量；再如引物退火，这会影响特异性。dNTP和模板同镁离子结合，降低了酶活性所需要的游离镁离子的量。最佳的镁离子浓度对于不同的引物对和模板都不同，但是包含200μMdNTP的实时定量PCR，使用3到5mM带有荧光探针的镁离子溶液（普通PCR是
1.5mM）。较高的游离镁离子浓度可以增加产量，但也会增加非特异性扩增，降低忠实性。为了确定最佳浓度，普通PCR从1mM到3mM，以0.5mM递增，进行镁离子滴定。为减少对镁离子优化的依赖，可以使用Transitor®HotStartTaq酶。
Transitor®HotStartTaqDNA聚合酶能够在比一般的TaqDNA聚合酶更广的镁离子浓度范围内保持功能，因此仅需较少的优化。
3.6模板质量
模板的质量会影响产量。DNA样品中发现有多种污染物会抑制PCR。一些在标准基因组DNA制备中使用的试剂，如SDS，在浓度低至0.01％时就会抑制扩增反应。分离基因组DNA较新的方法包括了DNAZol，一种胍去垢剂裂解液，以及FTAGeneGuardSystem，其可以同基质结合，在血液及其他生物样品中纯化贮存DNA。应注意进行PCR反应的模板质量，以增加PCR反应的成功率。
3.7模板浓度
起始模板的量对于获得高产量很重要。对大多数PCR扩增和荧光
PCR扩增，104到106个起始目的分子就足以观测到好的荧光曲线（或在溴化乙锭染色胶上观察到）。所需的最佳模板量取决于基因组的大小（下表）。举例说，100ng到1μg的人类基因组DNA，相当于3×104到3×105个分子，足以检测到单拷贝基因的PCR产物。质粒DNA
比较小，因此加入到PCR中的DNA的量是pg级的。对于一般的检测样品，10－100ng的量就足够检测了。当然对模板做一个梯度稀释，对于定量PCR
而言是非常容易，且能分析扩增效率。
表1.基因组大小和分子数目的比例
|
基因组 DNA |
Size(bp)* |
Target Molecules/µg of Genomic DNA |
Amount of DNA(µg) for -10^5 Molecules |
| E. coli | 4.7×106 | 1.8×108 | 0.001 |
| Saccharomyces cerevisiae | 2.0×107 | 4.5×107 | 0.01 |
| Arabidopsis thaliana | 7.0×107 | 1.3×107 | 0.01 |
| Drosophila melanogaster | 1.6×108 | 6.6×105 | 0.5 |
| Homo sapiens | 2.8×109 | 3.2×105 | 1.0 |
| Xenopus laevis | 2.9×109 | 3.1×105 | 1.0 |
| 1.0Mus musculus | 3.3×109 | 2.7×105 | 1.0 |
| Zea mays | 1.5×1010 | 6.0×104 | 2.0 |
| pUC 18 plasmid DNA | 2.69×103 | 3.4×1011 | 1×10-6 |
