细胞P38α激酶活性光度法定量检测试剂盒使用说明（二）
样品总活性测定
移取xx微升YIJI缓冲液（Reagent C）到新的比色皿
加入xx微升YIJI酶促液（Reagent D）
加入xx微升YIJI反应液（Reagent E）
加入xx微升YIJI底物液（Reagent F）
放进30℃培养箱里静置3分钟
加入5微升待测样品（注意：50微克细胞裂解蛋白；样品须溶解）
上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）
即刻放进分光光度仪检测，此为样品总活性读数：340波长读数0分钟 －340波长读数5分钟
样品非特异活性测定
检测开始前，移取xx微升YIJI缓冲液（Reagent C）到1.5毫升离心管，分别加入xx微升YIJI专性液（Reagent H）和待测样品（注意：50微克细胞裂解蛋白），混匀后，放进30℃培养箱里孵育30分钟。然后继续下列操作。
移取xx微升YIJI缓冲液（Reagent C）到新的比色皿
加入xx微升YIJI酶促液（Reagent D）
加入xx微升YIJI反应液（Reagent E）
加入xx微升YIJI底物液（Reagent F）
放进30℃培养箱里静置3分钟
加入20微升上述预处理的待测样品
上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）
即刻放进分光光度仪检测，此为样品非特异活性读数：340波长读数0分钟 －340波长读数5分钟
计算样品活性
样品总活性和非特异活性计算
2）样品特异活性计算
七、酶标仪测定
样品总活性测定
在96孔板上做好相应标记：背景对照和样品
分别移取xx微升YIJI缓冲液（Reagent C）到96孔板里
分别加入xx微升YIJI酶促液（Reagent D）
分别加入xx微升YIJI反应液（Reagent E）
分别加入xx微升YIJI底物液（Reagent F）
轻轻摇动96孔板
在30℃温度下孵育3分钟
分别加入xx微升YIJI阴性液（Reagent G）或待测样品（50微克细胞裂解悬液蛋白）到相应孔里（注意：样品须清澈）
轻轻摇动96孔板
即刻放进酶标仪检测：0分钟读数和5分钟读数
活性计算：
样品非特异活性测定
检测开始前，移取xx微升YIJI缓冲液（Reagent C）到1.5毫升离心管，分别加入xx微升YIJI专性液（Reagent H）和待测样品（注意：50微克细胞裂解蛋白），混匀后，放进30℃培养箱里孵育30分钟。然后继续下列操作。
在96孔板上做好相应标记：待测样品
移取xx微升YIJI缓冲液（Reagent C）到96孔板里
加入xx微升YIJI酶促液（Reagent D）
加入xx微升YIJI反应液（Reagent E）
加入xx微升YIJI底物液（Reagent F）
轻轻摇动96孔板
在30℃温度下孵育3分钟
加入20微升上述预处理的待测样品
轻轻摇动96孔板
即刻放进酶标仪检测：0分钟读数和5分钟读数
活性计算：
样品特异活性计算
八、抑制剂筛选
在96孔板上做好相应标记：背景、完全活性和待测抑制剂样品
按下表加入试剂，进行样品预处理
内容物 | 空背景对照 | 样本背景 | 完全酶活性 | 待测抑制剂酶活性 |
YIJI缓冲液（Reagent C） | xx微升 | xx微升 | xx微升 | xx微升 |
YIJI阴性液（Reagent G） | xx微升 | xx微升 | xx微升 | —— |
待测抑制剂 | —— | xx微升 | ―― | xx微升 |
用户自备的纯化酶 | —— | —— | xx微升（1毫单位） | xx微升（1毫单位） |
96孔板每孔总量 | 空背景对照孔 （xx微升） | 样本背景孔 （xx微升） | 完全活性孔 （xx微升） | 待测抑制剂样品孔 （xx微升） |
轻轻摇动96孔板，混匀，放进30℃培养箱里孵育30分钟。然后进行下列操作 |
分别移取xx微升YIJI缓冲液（Reagent C）到新的96孔板的所有孔里
分别加入xx微升YIJI酶促液（Reagent D）
分别加入xx微升YIJI反应液（Reagent E）
分别加入xx微升YIJI底物液（Reagent F）
轻轻摇动96孔板
在30℃温度下孵育3分钟
加入20微升上述预处理的待测样品
即刻放进30℃酶标仪检测：测读30分钟
抑制活性计算：
注意事项
本产品为20次操作
操作时，须戴手套
系统操作过程中，背景测定只需1次
样品处理忌用磷酸缓冲溶液
样品须澄清，至关重要
如果出现明显的干扰现象，建议使用样本背景对照去除任何内源性干扰因子
加入样品启动反应后3秒内即刻光度测定
测定值由高到低变化；测定可持续30分钟
光度测定后，比色皿须清洗彻底
样本测定0分钟读数高于5分钟读数表明具有酶活性
建议待测样本蛋白浓度为50微克/5微升（本公司提供 YIJI Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－YJ30030.1）
如果待测样品浓度过高或过低，可以调整样品浓度
可以使用P38α抑制剂（VX745；IC50=10纳摩尔）作为抑制剂对照或阴性对照
P38α激酶活性单位浓度定义：在30℃温度下，pH 7.6条件下，每分钟内能够氧化1微摩尔还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）所需的酶量作为一个活性单位
本公司提供系列蛋白激酶检测试剂产品
质量标准
本产品经鉴定性能稳定
本产品经鉴定检测敏感
