快速 PCR 定点突变实验
试剂、试剂盒 ATPdNTP 溶液SDM 缓冲液Taq DNA 聚合酶克隆化的 Pfu DNA 聚合酶Taq Extender PCR 添加剂Dpn I 限制性内切酶T4 DNA 连接酶模板 DNAdsDNA 质粒LB 琼脂平板
仪器、耗材 FALCON 2059 管子或替代物热循环仪水浴或适当的加热装置提前设定为 37°C、42°C、72°C 温箱琼脂糖凝胶电泳试剂和装置
实验步骤
一、材料
1. 缓冲液、溶液和试剂
ATP(10 mmol/L)
dNTP 溶液（包含所有 4 种 dNTP, 每一种 6.25 mmol/L)
SDM 缓冲液，10X(20 mmol/L Tris-HCl、pH7.5,8 mmol/L MgCl2，40ug/ml BSA)
2. 酶和酶缓冲液
Taq DNA 聚合酶
克隆化的 Pfu DNA 聚合酶（Stratagene)
Taq Extender PCR 添加剂（Stratagene)
Dpn I 限制性内切酶
T4 DNA 连接酶
3. 核酸和寡核苷酸突变引物
模板 DNA,dsDNA 质粒，小量或大量制备 [O.5pmol 模板=(0.33ug/kb)X 模板大小（kb)]
摸板 DNA 必须有甲基化的 Gm6 ATC 序列，如果没有，在进行 PCR-SDM 之前必须在体外用 Dam 甲基化酶进行甲基化。
只有包含抑菌抗生素抗性基因（如青霉素、四环素和氯霉素）的质粒适用于这个快速方案，也能够使用包含杀菌抗生素抗性基因（如卡那霉素和链霉素）的质粒，但在应用抗生素选择之前必須使被转化的细胞有一个生长的过程。参见第 14 步的注释。
突变引物 [15pmol 引物=(5ng/碱基）X 引物大小（碱基）]
在一条或两条引物上有磷酸基团十分重要，这种引物能够被 T4 多聚核苷酸激酶磷酸化或者直接合成 5'末端磷酸基团 。
4. 培养基
LB 琼脂平板（10 g 细菌培养用酪氨酸，5 g 细菌培养用酵母提取物，10gNaCl, 加 H20 至 1L, 最终 pH7.0, 每升加入 15 g 琼脂）
5. 特殊设备
FALCON 2059 管子或替代物
热循环仪
水浴或适当的加热装置，提前设定为 37°C、42°C、72°C
温箱，提前设定为 37°C
小离心管
6. 载体和菌株
E.coli 热休克感受态细胞（例如，XLl-blue，Statagene)
7. 附加项目
选项：琼脂糖凝胶电泳试剂和装置，包括溴化乙锭 (参见步骤 9）
二、方法
1.PCR
(1) 冰上，在一个已灭菌好的离心管中，混合 PCR-SDM 反应物。
模板 DNA 0.5pmol
SDM 缓冲液，10X 2.5ul
dNTP 溶剂（6.5 mmol/L) 1ul
突变引物 每种 15pmol
H20 补齐至 24ul
(2) 加入 2.5U 的 Taq DNA 聚合酶和 2.5U Taq Extender PCR 添加剂。
这些酶能够混合在一起，并且能够以 1:1(体积比）的混合物形式在-20°C 储存至少 3 个月。
(3) 按照如下的 PCR 条件进行 7~12 个循环的扩增。
可以根据不同种类的设备和反应体系对时间和溫度作出相应的调整，參见 31.2 PCR 注意事项。
如果热循环仪没有热盖，則要使用矿物油成石蜡来防止在 PCR 过程中反应混合物的蒸发。
2. 消化和拋光 PCR-SDM 产物
(4) 在 PCR 反应之后，将反应产物放置在冰上冷却 2 min。
(5) 将如下的组分直接加入到 25ul 扩增产物中。
Dpn I 限制性内切酶（10U/ul)1ul
Pfu DNA 聚合酶（2.5U/ul)1ul
如果在循环中使用矿物油覆盖在反应物上，那么在消化、拋光和连接过程中向反应管中加入附加组分的时候，一定要将微量移液器的尖端插入到矿物油层之下。
(6) 轻轻混合，然后将反应物置于一个离心管中离心 lmin。立即将反应物置于 37°C 温育 30 min。
(7) 将反应物置于 72°C 再温育 30 min。
3.PCR-SDM 产物的连接
(8) 将下列组分添加到用 Dpn I 和克隆化的 Pfu DNA 聚合酶处理过的产物中。
H2O 100ul
SDM 缓冲液，10X 10ul
ATP,10mmol/L 5ul
(9) 轻轻混合，然后将反应物罝于一个离心管中离心 1min。
可选做：为了证明 PCR-SDM 产物的完整性，从样品中取出 5ul 在标准的琼脂糖凝胶电泳中分析。应该能够观察到单一条带。
(10) 从上述反应物中取出 10ul 置于一个已灭菌的离心管中，加入 4U 的 T4 DNA 连接酶 (4U/ul)。
似乎不同批次的 T4 DNA 连接酶对于平端 DNA 分子的连接能力有相当的不同。这导致了突变效率的变化，在这种方法中，效率变化的范围可以从 30%~70%。一旦发现一批质量好的酶，推荐将其保存起来专门用作 PCR-SDM。
(11) 在 37°C 将反应物温育1h。
4. 转化感受态细胞（快速转化方案）
(12) 将热休克感受态细胞在冰上轻轻地解冻，然后取出 40ul 细胞到一个预冷的 FALCOL2059 聚丙烯管中。
(13) 向细胞中加入 1ul 连接酶处理过的 DNA，轻柔地搅拌，在冰上放置 30 min。
(14) 在 42°C 热激 30s，然后在冰上放置 2 min。
已经针对 FALCON2059 管优化过热激的条件了，如果采用不同的管，反应条件应该重新做相应的优化。
如果使用的质粒包含有杀菌型抗生素抗性基因，在冰上放置 2 min 后，需要添加 260ul LB, 在 37°C、250r/min 的条件下摇动 30 min, 然后继续第 15 步操作。
(15) 立即将所有体积的感受态细胞放置到包含有适当选择性抗生素的 LB 琼脂平板上涂板。将平板在 37°C 放置过夜。
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