快速 PCR 定点突变实验
实验方法原理 | 这种 PCR-SDM 方法的要点包括如下几个方面。1. 使用的模板浓度有所增加,这样就可以减少循环数,因此减少了非特异产物扩增的可能性。2. 加入了 Taq Extender, 扩增较长的 PCR 产物时产量和可靠性都有所提高。3. 使用 Dpm I 限制性内切酶,降低了母本分子的数量。4. 使用 Pfu DNA 聚合酶除去延伸出的碱基,提高了平末端连接的效率。 |
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实验材料 | 模板 DNA |
试剂、试剂盒 | ATP dNTP 溶液 SDM 缓冲液 Taq DNA 聚合酶 克隆化的 Pfu DNA 聚合酶 Taq Extender PCR 添加剂 Dpn I 限制性内切酶 T4 DNA 连接酶 模板 DNA dsDNA 质粒 LB 琼脂平板 |
仪器、耗材 | FALCON 2059 管子或替代物 热循环仪 水浴或适当的加热装置 提前设定为 37°C、42°C、72°C 温箱 琼脂糖凝胶电泳试剂和装置 |
实验步骤 |
一、材料 展开 |
注意事项 |
如果在循环中使用矿物油覆盖在反应物上,那么在消化、拋光和连接过程中向反应管中加入附加组分的时候,一定要将微量移液器的尖端插入到矿物油层之下。
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其他 |
基因工程和蛋白质工程研究经常用到基因突变技术制备突变体,用于研究基因调控,表达和蛋白质的结构与功能。传统的用于研究蛋白质结构与功能关系的方法有两种:(1)对蛋白质一级结构的氨基酸残基侧链进行修改;(2)蛋白质晶体结构的X射线衍射。虽然这些方法能提供一定量的信息,但受到很多条件的制约,用途有限。如果采用定点突变技术在克隆DNA的预定位点导入突变,然后再适当的宿主细胞-载体系统中表达经改造的基因突变体,则可通过比较突变体蛋白与野生型蛋白的性质,鉴定出蛋白质的结构和生物学功能至关重要的结构域和个别氨基酸残基。由于定点突变及克隆化基因的表达两方面的发展,使得突变体研究成为生物化学家和分子生物学家分析蛋白质结构和功能的首选方案。 展开 |
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