亲和层析的操作实验
试剂、试剂盒 非特异性竞争 DNA液氮缓冲液 Z缓冲液 Ze 柱再生缓冲液 柱保存缓冲液
仪器、耗材 EconoCoIumn 柱
实验步骤
材料与设备
EconoCoIumn 柱。（Bio Rad Laboratories731-1550)
非特异性竞争 DNA
液氮
试剂
缓冲液 Z
缓冲液 Ze
柱再生缓冲液
柱保存缓冲液
(配方，见“试剂的配制”，PP.131~138)
操作程序
下述实验是用缓冲液 Z 进行的，但用 TM 缓冲液也可得到好的结果。重要的是，应注意一些市售的 HEPES 和 PIPES 缓冲液中含有抑制蛋白质与 DNA 结合的混杂物, 因此，在某些方面，用 TM 缓冲液较为安全。有些转录因子如 SP1, 它们与 DNA 的亲和性在无 Mg2+存在时高于有 Mg2+存在时。因此，在层析缓冲液中，可能不用 Mg2+更有利一些，例如，Ze 缓冲液除不含 MgCl2，其他与缓冲液 Z 完全相同。虽然，在这里所述的操作程序中，其层析缓冲液含有 KCl, 但 KCl 多半能用 NaCl 代替。对纯化 AP-1 来说，可以用缓冲液 Z 也可以用 TM 缓冲液。
注：DNA 亲和层析一般在 4°C 下进行。不过，也已观察到有些序列特异性 DNA 结合因子结合 DNA(及 DNA 亲和介质) 的亲和性，室温约 (22°C) 时高于 4°C。因此，对于每一种因子, 重要的是要确定它的最佳结合温度。
1) 用 2X10 ml 缓冲液 Z+0.1mol/L KCl 平衡装于 2-ml Bio-Rad Econo 柱的 DNA 亲和介质（1 ml 柱床体积)。
2) 蛋白质组分（溶于 TM 缓冲液+0.1 ml/LKCl、缓冲液 Z+0.1mol/LKCl, 或缓冲液 Ze+0.1mol/LKCI 中) 与非特异性竞争 DNA 混合。
注：纯化 AP-1 时，将 0.51 ml 经超声处理的、浓度为 10A260nm 的 poly(dI-dC) 与约 25 ml 从 12 升 HeLa 细胞制备的 S-300 柱峰洗脱物 (在 TM 缓冲液+1mol/LKCl 中) 混合，浓度为 10A260nm 的 poly(dI-dC)≈850ug DNA/ml.
3) 蛋白质-DNA 混合物放置 10 min。
4) 混合物用 SS-34 转头，10000r/min 离心 10 min，沉淀不溶的蛋白质-DNA 复合物。将上清转移至新管。
5) 依靠重力液流（15 ml/h/柱) 加载于层析柱。
注：从 12L 细胞纯化 AP-1 时，一根 1-ml 柱应已够用。纯化大量原料时，则可平行使用多根 1-ml 柱，不过，通常在一根 1-ml 柱上可加载多达 50 ml 的蛋白质样品。
6) 加载原材料后，用 4x2 ml 的缓冲液 Z(或 Ze)+0.1mol/L KCl 洗柱。
注：在本步中，彻底清洗亲和柱是非常重要的。DNA 亲和柱通常可使待分离因子获得 100 倍以上的纯化。不过，蛋白质纯化 100 倍时，原材料中即使有 1% 的杂蛋白也会因亲和层析柱清洗不彻底而成为亲和层析纯化的转录因子的主要杂质。
7) 用依次添加有 1-ml 含 0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 和 0.9mol/L KCl 的缓冲液 Z,3Xlml 含1mol/LKCl 的缓冲液 Z 从柱上洗脱蛋白质。分部收集对应于所加的 1-ml 缓冲液部分的 1-ml 组分。
注：当纯化新因子时，还应包括一步含 2mol/L NaCl 的盐溶液洗脱。因为在少数例子中已发现，在1mol/L 盐浓度下，序列特异性结合蛋白仍能与亲和介质结合（在这些例子中, 这些因子要用 2mol/L 的盐溶液来洗脱)。当用浓度大于 1mol/L 的盐溶液洗脱时，因 NaCl 的溶解度高于 KCl, 故用 NaCl 比用 KCl 好。
8) 每个组分均留 2 份等分试样（40ul 用于 SDS-PAGE 分析，25ul 用于 DNA 酶 I 足迹分析) 保存于 4°C, 各组分的其余部分液氮冷冻后，保存于-80°C。
9) 亲和介质再生如下：室温下，停止各亲和柱的液流，然后给毎根柱加 5 ml 柱再生缓冲液。用细的硅化玻璃棒搅拌介质，使介质与柱再生缓冲液混合。让缓冲液从柱下流出。再停止液流后，重复上述加缓冲液及其与介质混合的步骤。然后，用 2X15 ml 柱储存缓冲液平衡，并将介质保存于 4°C。
10) 分析蛋白组分的序列特异性 DNA 结合活性 (对亲和层析纯化的 AP-1，其 8%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳银染结果见图 2-4)。如需进一步纯化，可将含有活性的组分合并。然后（用不含 KC1 的缓冲液 Z) 稀释合并的组分，或 (对缓冲液 Z+0.1mol/LKCl) 透析，至 KCl 终浓度为 0.1mol/L。将该蛋白组分与非持异性竞争 DNA(所需的种类和用量需由实验确定混合，再用亲和层析柱纯化。
