为纯化钙调蛋白，对平滑肌组织提取物的粗分级分离采取了两步不同的操作：硫酸铵沉淀和等电点沉淀。这两步操作利用了钙调蛋白的两个不同的性质，即它在中性以上 pH 条件下的高溶解度和它的酸性等电点。本实验来源于蛋白质纯化与鉴定实验指南，作者：朱厚础。
| 试剂、试剂盒 | 上清固体硫酸铵浓硫酸Tris 碱缓冲液 B |
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| 仪器、耗材 | 聚丙烯烧杯磁力搅拌器与搅拌子聚碳酸酯离心管超速离心机带刻度的聚丙烯量筒粗棉布聚丙烯漏斗橡皮淀帚 刮勺透析袋 |
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| 实验步骤 | 材料与设备
上清，得自实验 2(约 700~1000 ml)
固体硫酸铵
聚丙烯烧杯（2x4000-ml)
磁力搅拌器与搅拌子
聚碳酸酯离心管（6x500-ml)
超速离心机，备有 3000-ml 容积的转头
带刻度的聚丙烯量筒（2x4000-ml)
粗棉布
聚丙烯漏斗（大的，宽嘴型）
浓硫酸（稀释至 50%v/v 水溶液）
橡皮淀帚/刮勺
Tris 碱（1mol/L; 约 10 ml)
聚丙烯漏斗（小的，具长茎的）
透析袋（标称截留分子量 6000~8000Da; 洗浄)
试剂
缓冲液 B(10x)(临用前配制 4000 ml 1x 缓冲液 B，并加 2-巯基乙醇至 1 mmol/L)
(配方，见“试剂的配制”，PP.82~83)
操作程序
1) 以实验 2 所得上清的体积为基础（减去为测活而取出的等分试样，于硫酸铵表 (见附录 4) 上査出配成 0%~60% 饱和度所需的固体硫酸铵量。应为 361 g/L。称取适量硫酸铵，并将团块研碎成细粉 。
2) 将上清置 4000-ml 聚丙烯烧杯中，并放人大的磁力搅拌子。置冷室的大磁力搅拌器上慢慢搅拌。于 20 min 内缓慢抖动加人硫酸铵。如固体硫酸铵沉于烧杯底部，可停几分让其溶解。然后再继续搅拌 40 min(即，共 60 min)。
3) 将混合物转至 500-ml 聚碳酸酯离心管，平衡后，置超速离心机中，4°C,8000r/min 离心 60 min。
4) 移出上清，倒人铺有两层粗棉布的聚丙烯漏斗后收集于带刻度的聚丙烯量筒中。弃去沉淀物。记录上清液的体积。留 1% 的体积供以后测活用。你将需要这两个体积作计算。
5) 将上清移至 4000-ml 聚丙烯烧杯。用 pH 计测量，中速搅拌，加 50%(v/v) 硫酸溶液，至 pH 达约 4.05。努力让 pH 低于 4.1 髙于 4.0。
6) 烧杯置冷室, 搅拌 1h。
7) 将上清移至 500-m l 聚碳酸酯离心管。于超速离心机中，4°C,8000r/min 离心 60 min。
8) 移出上清并弃去。用橡皮淀帚，重悬沉淀物于几毫升含几滴 1mol/LTris 碱的蒸馏水中。应以最小的体积重悬沉淀物。
9) 戴上手套，将悬液转移至透析袋。用具长茎的聚丙烯小漏斗灌人透析袋。排出过量的空气，留出 50% 空余（透析袋应是瘪的，无空气）。透析袋两头至少打双结扎紧或用夹钳夹紧。
10)40°C 下，对蒸馏水透析 4 h, 其间换液一次。然后，转至 4000 ml lx 绥冲液 B 中，继续透析过夜（4°C)。在所有透析的情况下，均由小搅拌子在烧杯中缓慢搅拌，混匀透析液。不能让搅拌子碰击透析袋，否则透析袋会破裂。 |
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