非标记抗体免疫酶组织化学实验——PAP 法
| 实验方法原理 | 与酶桥法相似，不同的是酶桥法分四步，而 PAP 法分三步。PAP 法将酶桥法的步骤（3）、步骤（4）合二并为一，用 PAP 复合物替代，故称 PAP 法（图 4-9）。PAP 复合物中的抗 HRP 抗体和第一抗体必须为同一种属动物的 IgG，这样桥抗体才能作为「桥」将 PAP 复合物连接在第一抗体上，如特异性一抗为鼠来源的，那么 PAP 复合物必须用鼠的。 |
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| 实验材料 | |
| 试剂、试剂盒 | |
| 仪器、耗材 | |
| 实验步骤 | 1. 4 μm 石蜡切片 58℃ 烤片 4 h，切片常规脱蜡至水。 2. 蛋白酶消化或 AR（组织抗原的暴露或抗原的修复，此步视情况而定）。 3. 0.3％ H2O2 处理切片 20 min（室温），PBS 洗 3 min × 2 次。 4. 3％ 正常动物血清处理切片 30 min（室温），吸去多余血清，不洗。 5. 适当稀释的特异性一抗孵育（4℃ 过夜或 37℃60 min），PBS 洗 3 min × 3 次。 6. 滴加桥抗体（二抗），37℃ 孵育 40 min，PBS 洗 3 min × 3 次。 7. 适当稀释的 PAP 复合物（要求与特异性一抗同一种属）37℃ 孵育 40 min。 8. PBS 洗 3 min×3 次。 9. 0.04％ DAB-0.03％ H2O2 显色 8～12 min。 10. 水洗、复染、脱水、树胶封片，结果观察。 展开 |
| 注意事项 | 1. 假阴性及其处理 应用 PAP 法显示抗原含量较多的组织或冰冻切片抗原保存良好的标本时，可导致阴性结果。Bigbee（1977）的研究证实，阴性结果是由于第一抗体用董过高，与组织抗原结合过多，使相邻两个抗体的 Fc 段间的距离恰好是连接抗体的两个 Fab 段结合的长度，于是连接抗体不存在游离 Fab 段，仅存无活性的 Fc 段，所以不能将 PAP 复合物连接在与组织抗原结合的第一抗体上，导致阴性结果。尤其是冰冻切，而石蜡切片很少发生这种现象。克服的办法是将第一抗体尽量稀释。 2. 桥抗体 也称连接抗体。它的两个 Fab 段具有相同的结构、性质及与抗原结合的能力，因此，当第一抗体和 PAP 复合中抗 HRP 抗体来自同一种属动物时，桥抗体能同时与上述二种抗体结合，起到桥的作用。为丁确保桥抗体的二个 Fab 段之一与第一抗体结合，另一个与抗 HRP 抗体结合，桥抗体的浓度必须高于常规用的第二抗体。 3.PAP 复合物 在 PAP 法和酶桥法中，特别强调第一抗体和抗 HRP 必须来自同一种属，桥抗体才能发挥桥的作用，将其连接在一起。 展开 |
