自噬双标腺相关病毒说明(二)
(Tom Egil Hansen and Terje Johansen,BMC Biology,2011)
图4 Vigene自噬双标病毒载体图谱
五.Vigene mCherry-GFP-LC3B 自噬双标操作方法
(一)体外实验
以2型AAV病毒为例,Vigene为您推荐的MOI值104-105,是根HEK293细胞得出的数据,不同的细胞所使用的病毒MOI值会有所不同。建议您感染目的细胞前,进行预实验摸索最佳MOI值,推荐使用有荧光的对照病毒来摸索条件。
1. 为了节省病毒,推荐使用96孔板进行预实验。
2. 将目的细胞接种于96孔板中,细胞融合率为50%为最佳。为保证细胞生长良好,请保证细胞贴壁过夜。
3. 取10ul AAV病毒原液加入90 ul培养基中做1:10稀释(10-1),以此为起点做梯度稀释直至稀释10-7。可根据实际情况降低或提高稀释倍数。
4. 取出提前准备好的96孔板,先确定细胞生长状况是否良好。用准备好的病毒稀释液替代旧培养基,注意保留未加入病毒的细胞孔作为对照组。
5. 在加入病毒稀释液后,请在12-24h后观察细胞状态来确认加入的病毒量是否合适,是否因为加入的病毒量影响细胞状态。如果细胞没有变化,即所加病毒对细胞没有毒性,可以继续培养。
6. AAV病毒对细胞的感染较慢,请在感染细胞后每天观察细胞中荧光表达情况。
另:如果您选择的产品没有荧光标签请在96小时以后的不同时间段分别收获细胞并通过Western-Blot或其他检测手段来检测基因表达。
注:由于AAV组织特异性,体外感染细胞的效率比较低,所以我们强烈推荐您购买AAV用于动物实验。
(二)体内实验
针对小鼠/大鼠来说,研究不同的方向有不同的AAV注射方法,详情可查阅Vigene官网。
六.常见问题解答
1.重组AAV 安全吗?
迄今为止,未发现野生型AAV有致病性。野生型AAV,在无需辅助病毒(如腺病毒)的存在下,复制效率非常低。重组腺相关病毒(rAAV)由多个质粒(cis质粒、辅助质粒、rep/Cap质粒)组成。Cis质粒、辅助质粒与rep/Cap质粒之间不具有同源性序列,因此重组AAV在理论上不具有复制的能力。
2.哪些血清型的 AAV 可供选择?我该选用哪种AAV呢?
目前为您提供的AAV 血清型为AAV1,AAV2,AAV5,AAV7,AAV6,AAV8 & AAV9。请参阅下面指南中参考文献的建议。
3.使用重组腺相关病毒rAAV传递基因的优势是什么?请同时参阅转染效率与不同细胞类型对照表,以确定哪种血清型AAV更适合您的细胞。
rAAV病毒滴度很高,可感染分裂和非分裂细胞、免疫原性极小、体内表达外源基因时间长。
4.AAV 载体稳定吗? 如何保存AAV载体?
纯化的AAV载体在4℃或更低温度下高度稳定。建议您将AAV分装后,-80℃下长期保存。
5.订制AAV服务,客户需要提供哪些材料? &客户收到的产品是怎样的?
您可以从我们的人源全长cDNA库(17,000预制ORF)中挑选,或者提供您的质粒DNA或DNA序列,我们将基因克隆至AAV载体。您还可以指定特定的融合标签和AAV血清型。
基因沉默服务,请您提供确切的shRNA的序列以构建重组rAAV载体。我们的标准载体具有U6启动子和GFP标记。
通常情况下,可为客户提供500 ul病毒液1×10^12 V.G. /mL。也可根据客户的需要,提供特定体积和滴度的产品。
附:Vigene自噬双标系统感染诱导自噬的HEK293细胞效果图