病毒包装技术——腺相关病毒(AAV)包装（一）
摘要:
腺相关病毒(AAV)是一种人细小病毒， 因为能作为一种基因治疗载体而受到广泛关注。目前大多数生成rAAV的实验方案需要共转染一个载体质粒和一个表达病毒复制和结构基因的包装质粒到腺病毒(Ad)感染的培养细胞中。但是也可以通过新的辅助质粒(pH3和pH5)，排除了Ad共转染的需求。辅助质粒表达AAV的rep和cap基因和Ad E2A、VAI和E4基因。当辅助质粒在没有Ad感染的情况下共转染到人293细胞中，rAAV载体产量超过了pAAV/Ad包装质粒的80倍。另外，有复制能力的AAV在rAAV制备过程中少于0.00125%。该双质粒转染系统因其简便性和高产出而使AAV载体系统能被更广泛地使用。
1．简介
腺相关病毒(AAV)是一个常见的人细小病毒，自然缺陷、无包被和无致病原性。AAV复制周期由两个明显的阶段构成：潜伏期和增殖期。在缺少辅助病毒诸如腺病毒(Berns,1990;Muzyczka,1992;Berns和Giraud,1996)、疱疹病毒、牛痘病毒或者在基因毒条件下(Yakobson等,1989),AAV能复制产生子代病毒颗粒。在缺少辅助病毒的情况下，腺相关病毒整合其基因组到19号染色体的一个特别位点并保持整合直到随后的辅助病毒将其从潜伏状态下拯救出来(Kotin等，1990)。AAV的位点特异性的整合能力、其自然缺陷以及其无致病原性使其成为基因治疗载体成为可能。AAV基因组是一个线性、单链(ssDNA)分子，4680个核苷酸，在每个末端含有一个145个碱基末端重复序列(TR)（Srivastava等,1983）。TR序列折叠成发卡结构作为DNA复制起始和包装重组AAV基因组为感染性的病毒颗粒所需的唯一已知顺式作用元件。
重组腺病毒载体(rAAV)的构建通常涉及rep和cap基因的剔除和将感兴趣的转基因插入TR元件之间。关键的Ad辅助基因包括：E1a转录激活Ad以及AAV基因，E1b和E4编码增进mRNA装运到细胞质的蛋白质，E2a表达一个ssDNA结合蛋白质促进AAV DNA复制，VAI RNA基因生成一个小RNA转录物增进AAV capsid mRNA的翻译。
此繁琐过程的局限性阻止了rAAV广泛发展为基因治疗的载体。如上所述载体的生成总是导致载体的明显Ad污染，因此需要热处理和严格的纯化方法灭活和去除Ad病毒颗粒污染。尽管载体和包装质粒之间通常没有同源序列，但是经常产生野生型样有复制能力的AAV(rcAAV)(Allen等，1997；Wang等，1998)。已经进行了许多尝试改进rAAV载体的包装效率。它们包括：发展表达一些或所有包装所需的AAV基因的细胞系（Yang等,1994;Clark等,1995;Tamayose等,1996;Inoue和Russell,198），构建Ad辅助质粒能够用来替代Ad感染(Matsu***a等,1998;Xiao等，1998b)和发展重组Ad携带rAAV载体基因组(Gao等,1998)。
我们已经构建了新的辅助质粒，完全不用在rAAV包装过程中感染Ad。这些质粒含有Ad基因组的VA、E2a和E4基因以及AAV的rep和cap基因。当转染到含有Ad5E1a和E1b基因的人293细胞中，辅助质粒提供了一个有效的、无Ad污染的包装系统。我们用此新系统所产生的rAAV滴度与大多pAAV/Ad包装质粒(Samulski等,1989)相比提高了80倍。另外，Ad再也不能产生，有复制能力的AAV在任何载体制备过程中尚未发现。
2.材料和方法
2.1. 质粒、细胞和病毒
一个rAAV载体质粒，表达人绿色荧光蛋白的pTR-UF5(Peel等,1997)被用到所有包装实验中来优化该系统。这个pAVbgal载体质粒含有AAV TR，位于巨细胞病毒(CMV)早期转录启动子和E.coli b半乳糖苷酶基因的两侧。PAAV/Ad质粒被用来作为一个包装质粒与辅助质粒进行比较(Samulski等，1989)。pCDMrep质粒含有AAVrep基因，受CMV早期启动子的调控(Yang和Trempe，1993)。
19193bp的辅助质粒，pSH3和pSH5可以通过几个步骤来构建。一个1.5kb含有VAI和VAII基因的HindIII到SalI的片段(来自Ad5的nt9831-11555)被插入到pGEM3Z的同一位点产生pVA3。将一个5.8kb含有E2a基因的BamHI和EcoRI的片段(来自Ad的nt21563-27331)插入到pVA3的同样位点中产生pVA3E2a。来自pSub201的4.3kb XbaI片段(AAV2中的nt177-4471)，包含AAV rep和cap基因，随后被插入到pVAE2aE4的两个XbaI位点。其中一个pVAE2aE4上的XbaI位点位于E2a和VAI和II基因片段，另外一个位点(在Ad2基因组的nt10580)在VAI基因的上游被发现。两个版本的辅助质粒(pSH3和pSH5)区别在于4.3kb XbaI插入片段的方向，并在Fig.1B显示。 pSH3和pSH5辅助质粒保存在E.coli的HB101株中。质粒从500ml的细菌培养物中纯化出来，其分为4´125m，每个部分用Qiagen Plasmid Maxi试剂盒的方法处理。 人293(Ad-5转化胎肾上皮)细胞和Hela细胞在补充有10%胎牛血清和抗体的EMEM中培养。细胞在37°C、5％CO2的单层培养基中培养。对照的包装实验感染倍数(m.o.i)为15的Ad5型在无血清培养基中培养1h，随即进行转染。Ad通过在Hela细胞上的噬斑形成滴定。 Fig.1. rAAV包装所用的质粒(A)pTR-UF5含有CMV启动子(箭头)所驱动的人gfp基因和HSV－tk启动子(箭头)所驱动的neoR基因。整个构建的两侧有AAV TR元件(填充的方块)。pAVbgal含有E.coli b-半乳糖苷酶基因，受CMV启动子(箭头)所控制。转录盒两侧是AAV TR元件（填充的方块）。pAAV/Ad含有AAV rep 和cap基因，两侧是Ad末端重复元件（空方块）（B）pSH3和pSH5含有Ad E4,E2a和VA RNA基因。两个质粒也含有AAV rep和cap基因。图下的数字指的是Ad和AAV基因组中的核苷酸数目。pSH3和pSH5的区别是在AAV DNA序列中的方向。为了清楚，质粒图谱的其余部分未列。
2.2. rAAV载体产生和滴定 对于小规模的包装实验，8´105 293细胞在35mm6孔盘上种植。24小时后，根据生产商的方法用lipofectamin（Life Technologies）一式三份转染培养物。对于开始的优化实验，所用的载体对辅助质粒的比例在表1列出。根据载体和辅助质粒的大小，1mg:3mg比例相应于1:1的pTR-UF5对pSH3/5的摩尔比。pAAV/Ad质粒与Ad共感染，3或5mg的pAAV/Ad与1mg的pTR-UF5共感染。pGEM3Z质粒(Promega)被共转染后保持不同转染的相同总DNA浓度。对于伴随Ad感染的转染，在加入DNA到细胞前病毒被吸附到无血清培养基中细胞单层上1h。转染后72小时，细胞被刮到2ml培养基中收获起来。细胞随后用1ml无菌PBS清洗。PBS清洗液加到细胞悬浮物中，冻融5次后超声破碎(3,36mm 45s)。提取物在4000´g离心10分钟去除细胞碎片，裂解液上清含有重组载体vAVgfp，它将被用到随后的转导中。在转导之前，这些转染的Ad用 56°C热处理30分钟。 对于大规模载体包装，20´1 125px的培养盘，每个含有5´106 293细胞，以及用钙磷酸盐沉淀方法(Wigler等,1979)转染了10mg pAVgal和50mg pSH3。72小时后，收获培养物，低速离心沉淀细胞，沉淀冻融4次，如前所述超声破碎。CsCl2加到裂解物中，终浓度为1.41g/ml，用折射指数确定。悬浮物在SW41转头上40 000rpm离心48小时。将含有可见载体的条带从梯度中去除，其密度可通过测量折射指数来确定。CsCl2离心步骤重复，获得的载体制备后进行透析，更换4次PBS，保存在－80°C。产生的载体vAVgal按下述方法滴定。 为了确定rAAV的滴度，4´104Hela细胞被种植到24孔培养盘中，感染m.o.i为10的Ad，用系列稀释的转染细胞裂解液进行转导。2、3天后，在广泛细胞病理效应被发现之前用带有EPI-荧光设备的DIAPHOT-***理光倒置显微镜在20倍下观察。计数产生良好分离的荧光细胞载体的稀释倍数。因而，每个阳性细胞代表了一个载体转导单位（T.U.）。为了确定rAAVgal载体的滴度，纯化载体的稀释液被用来感染细胞。细胞用PBS溶解的95％甲醇固定，用X-gal显色。每个蓝染的细胞代表一个载体转导单位(T.U.)。 载体基因组拷贝数用点印迹杂交分析来确定，如前所述方法测定A260(Fisher et al.,1996)。对于6孔盘的小规模包装实验，制备的原始载体用DNase I在37°C处理30分钟。DNase 在75°C灭活，蛋白质用50mM Tris 1mM EDTA 0.1%SDS 0.5mg/ml蛋白酶K在37°C消化12小时。对于CsCl2纯化的载体，使用相同的步骤，但不用DNase步骤。载体DNA煮沸5分钟，用Bio-Dot装置(Bio-Rad)加到硝酸纤维素膜上（Schleicher和Schuell）。每个孔用0.5M乙酸胺300ml(pH5.2)洗涤。洗涤印迹按照2.4部分 Southern blot方法处理，载体特异的探针标记，暴露于Kodak X-omat X线胶片(Eastman Kodak)。比较载体杂交信号与已知稀释浓度印迹到同样滤膜上的质粒DNA，精确估计基因组拷贝数。用Ambis Image Acquisition and Analysis系统定量杂交滤膜上的放射性和X-线胶片上的光密度。
