蛋白等电聚焦凝胶电泳技术（二）
6．电泳聚焦后处理
测定pH梯度：
1）将凝胶条切成0.5cm或1cm的小片；
2）将每小片凝胶在1ml 10mM KCl中 浸泡30min；
3）测读此KCl溶液的pH值、
凝胶的固定：
1）将凝胶于10%三氯乙酸中浸泡10min；
2）换成1%三氯乙酸溶液继续浸泡至少2h以上，以去除载体两性电解质，浸泡过夜可以更好的降低考马斯亮蓝对载体两性电解质的染色。
凝胶的染色：用考马斯亮蓝染色，然后脱色，制成干胶。
7.天然等电聚焦电泳的修正方案
如果要进行天然等电聚焦电泳，要做一些修改；
1） 胶过程中配的凝胶中不需要加尿素；
2）上样缓冲液（2×）5ml：其中1.8ml水，200μl载体两性电解质（同制胶成分），3ml甘油，上样时候于等体积样品混匀，10000×g离心5敏即可上样；
3）室温下电泳，接好电极，恒压下先200V电泳1.5h，再400V电泳1.5h。
8.常见问题及解释
1） 若产生模糊条带则证明聚焦不完全，这可能是由于电泳中的问题或大分子蛋白质限制了其在凝胶中的迁移能力。若聚焦时间过长或过短，条带的分辨率会下降。增加电压梯度可以使带形更加锐利。高分子量蛋白质在琼脂糖凝胶中可以聚焦的更好。
2） 产生歪斜的条带通常由于不正确的pH梯度，检查电极是否洁净，是否同凝胶链接良好，同时应该注意凝胶的边缘效应。
3） 蛋白带的纹理现象是等电聚焦中经常遇到的问题，可能是一下原因：
a，蛋白质聚集或沉淀（尤其在等电点附近），或上样量过大，8M尿素通常用来防止蛋白质聚集，去垢剂Triton X－100和NP－40常用来防止膜蛋白的聚集，所以上样前一定要离心以除去不溶解的颗粒；
b，样品中残存核酸，可以采用多种方法去除核酸污染，如酸抽提、盐沉淀、核酸酶消化等；
c，蛋白质修饰，非超纯级的尿素中的异氰酸盐污染物可能导致蛋白质的氨甲酰化，预电泳可以去除异氰酸盐，蛋白质样品处理或储存不当会发生包括Cys残基氧化，Asn或Gln残基去氨基化等修饰过程；
d，波浪形条带常由于样品中盐浓度过高，有时候载体两性电解质或电极液不纯或电极不洁净也会产生波浪形条带；
e，电极同凝胶连接不平行，配置凝胶时候试剂不纯，载体两性电解质浓度过低可导致不均等的pH梯度，若凝胶碱性部分pH梯度丢失，其可能原因是阳极飘移，可以补充pH9－11的载体两性电解质或进行非平衡pH梯度电泳；
f，染色时候高背景的产生可能由于固定后载体两性电解质仍残留于凝胶中，增加1％三氯乙酸的固定时间可解决；
g，蛋白质条带丢失或过淡可能由于蛋白质分子量较低（<10kDa〉或蛋白质在固定中未被变性，增加三氯乙酸浓度或使用戊二醛固定即可；
h，复杂的蛋白质混合物等电聚焦后可以产生相互重叠的斑点，改变等电聚焦凝胶pH范围可以解决此问题。进一步的蛋白质纯化或免疫沉淀处理可以避免重叠斑点的产生。
9．其他要注意的事项
1）等电聚焦后可用一根染色的细线（0.1mm）标出染料前沿的位置；
2）不同品牌的载体两性电解质性质上有细微的差别，使用不同来源的载体两性电解质凝胶时候蛋白质分离样式略有差异，若要获得最好的重复性一般不要更换载体两性电解质的品牌；
3）通常，窄范围的pH梯度可以提高分辨率，但是需要时间也比较常，pH梯度范围为2是较好的选择；
4）由于电源和凝胶冷却系统的限制，最长的凝胶长度为8－10cm，实际上，分别电泳几块不同的pH梯度的凝胶比只电泳一块较长凝胶效果更好；
5）当等电聚焦电泳时间很长时候（>3000V·h），由于载体两性电解质不稳定造成的阴极漂移将成为严重问题，阴极漂移会破坏pH梯度，尤其是pH8以上的梯度，为了克服此问题，开发了一种较短时间（1600V·h）完成等电聚焦电泳的技术，即非平衡pH梯度电泳，这样可以在高pH范围内聚焦蛋白质，但该方法不能用来测定蛋白质等电点。
6）尿素可以促进蛋白质溶解，并消除蛋白质－蛋白质及蛋白质－脂类相互作用，可增加聚焦速度和提高分辨率，同时抑制阴极漂移，但是也要注意变性蛋白质的等电点可能同天然蛋白有所差异。
7）若蛋白溶液中含有SDS，可加入尿素至终浓度8M，在高浓度的尿素下，SDS同蛋白质的相互作用极小。
8）在变性液中加入2%Triton X－100以保证蛋白质（尤其是膜蛋白）的充分溶解，有些作者推荐使用如CHAPS和Zwittergent3－14等两性离子去垢剂；
9）超薄凝胶（50-500um）比常用标准等电聚焦更有优势，因为高电场强度和更佳的冷却效果使聚焦速度更快，分辨率更高。
10）在聚丙烯酰胺等电聚焦凝胶中，高分子量蛋白质（>750kd）常常表现异常的迁移行为，琼脂糖凝胶或琼脂糖－丙稀酰胺凝胶较适用于高分子量蛋白质。
11） 考马斯亮蓝染色中，三氯乙酸固定后用0.25％SDS的乙醇：醋酸：水（33：10：57）溶液洗涤凝胶10-30min可以进一步改善染色效果。SDS同载体两性电解质结合后可以更好的去除载体两性电解质。
10.固相pH梯度等电聚焦电泳
简介：固相pH梯度等电聚焦是80年代建立起来的一种等电聚焦技术，其所用的介质是一些具有弱酸或弱碱性质的丙稀酰胺衍生物，它们于丙稀酰胺和甲叉双丙稀酰胺有相似的聚合行为。固定化电解质一端的双键可以在聚合中共价结合到聚丙烯酰胺介质中，其另一端的R集团为弱酸或弱碱，可在聚合物中形成弱酸或弱碱的缓冲体系，利用缓冲体系滴定终点附近一段pH范围就可行成近似线性的pH梯度，所以固相pH梯度与载体两性电解质pH梯度的区别在于前者的分子不是两性分子，在凝胶聚合时候便形成pH梯度，不随环境电场条件的改变而改变，后者是两性分子，在电场中迁移到自己的等电点后才形成pH梯度。固相pH梯度等电聚焦比传统等电聚焦具有更高的分辨率，更大的上样量，其分辨率可达到0.001pH，是目前分辨率最高的电泳方法之一。
