蛋白等电聚焦凝胶电泳技术（二）
5.电泳
操作步骤：
1）将蛋白样品于等体积的2×上样缓冲液混合，10000×g离心5min以除去蛋白质沉淀；2）用微量注射器将蛋白质样品加入到上样空底部，注意不要溢出来。注意：对于考马斯亮蓝染色液来说，每个泳道10-30ug的蛋白混合粗提物（我们俗称粗抗原）或者5-10ug单一蛋白组分是较合理的上样浓度。
电泳液：
1）上槽中加入阴极电泳液（20mM氢氧化钠：须由1M储存液新鲜配置）；
2）下槽中加入阳极电泳液（10mM磷酸：须由1M储存液新鲜配置）。
等电聚焦电泳条件：
1）接好电极；
2）恒压150V电泳30min；
3）恒压200V电泳2.5h，开始时候控制电流为10mA左右，在聚焦过程中电流有所下降，电泳内室温度在电泳的过程中将升至40－50摄氏度。
6．电泳聚焦后处理
测定pH梯度：
1）将凝胶条切成0.5cm或1cm的小片；
2）将每小片凝胶在1ml 10mM KCl中 浸泡30min；
3）测读此KCl溶液的pH值、
凝胶的固定：
1）将凝胶于10%三氯乙酸中浸泡10min；
2）换成1%三氯乙酸溶液继续浸泡至少2h以上，以去除载体两性电解质，浸泡过夜可以更好的降低考马斯亮蓝对载体两性电解质的染色。
凝胶的染色：用考马斯亮蓝染色，然后脱色，制成干胶。
7.天然等电聚焦电泳的修正方案
如果要进行天然等电聚焦电泳，要做一些修改；
1） 胶过程中配的凝胶中不需要加尿素；
2）上样缓冲液（2×）5ml：其中1.8ml水，200μl载体两性电解质（同制胶成分），3ml甘油，上样时候于等体积样品混匀，10000×g离心5敏即可上样；
3）室温下电泳，接好电极，恒压下先200V电泳1.5h，再400V电泳1.5h。
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