蛋白等电聚焦凝胶电泳技术（三）
8.常见问题及解释
1） 若产生模糊条带则证明聚焦不完全，这可能是由于电泳中的问题或大分子蛋白质限制了其在凝胶中的迁移能力。若聚焦时间过长或过短，条带的分辨率会下降。增加电压梯度可以使带形更加锐利。高分子量蛋白质在琼脂糖凝胶中可以聚焦的更好。
2） 产生歪斜的条带通常由于不正确的pH梯度，检查电极是否洁净，是否同凝胶链接良好，同时应该注意凝胶的边缘效应。
3） 蛋白带的纹理现象是等电聚焦中经常遇到的问题，可能是一下原因：
a，蛋白质聚集或沉淀（尤其在等电点附近），或上样量过大，8M尿素通常用来防止蛋白质聚集，去垢剂Triton X－100和NP－40常用来防止膜蛋白的聚集，所以上样前一定要离心以除去不溶解的颗粒；
b，样品中残存核酸，可以采用多种方法去除核酸污染，如酸抽提、盐沉淀、核酸酶消化等；
c，蛋白质修饰，非超纯级的尿素中的异氰酸盐污染物可能导致蛋白质的氨甲酰化，预电泳可以去除异氰酸盐，蛋白质样品处理或储存不当会发生包括Cys残基氧化，Asn或Gln残基去氨基化等修饰过程；
d，波浪形条带常由于样品中盐浓度过高，有时候载体两性电解质或电极液不纯或电极不洁净也会产生波浪形条带；
e，电极同凝胶连接不平行，配置凝胶时候试剂不纯，载体两性电解质浓度过低可导致不均等的pH梯度，若凝胶碱性部分pH梯度丢失，其可能原因是阳极飘移，可以补充pH9－11的载体两性电解质或进行非平衡pH梯度电泳；
f，染色时候高背景的产生可能由于固定后载体两性电解质仍残留于凝胶中，增加1％三氯乙酸的固定时间可解决；
g，蛋白质条带丢失或过淡可能由于蛋白质分子量较低（<10kDa〉或蛋白质在固定中未被变性，增加三氯乙酸浓度或使用戊二醛固定即可；
h，复杂的蛋白质混合物等电聚焦后可以产生相互重叠的斑点，改变等电聚焦凝胶pH范围可以解决此问题。进一步的蛋白质纯化或沉淀处理可以避免重叠斑点的产生。
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