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蛋白等电聚焦凝胶电泳技术（四）

2020.4.15

9．其他要注意的事项

1）等电聚焦后可用一根染色的细线（0.1mm）标出染料前沿的位置；

2）不同品牌的载体两性电解质性质上有细微的差别，使用不同来源的载体两性电解质凝胶时候蛋白质分离样式略有差异，若要获得好的重复性一般不要更换载体两性电解质的品牌；

3）通常，窄范围的pH梯度可以提高分辨率，但是需要时间也比较常，pH梯度范围为2是较好的选择；

4）由于电源和凝胶冷却系统的限制，长的凝胶长度为8－10cm，实际上，分别电泳几块不同的pH梯度的凝胶比只电泳一块较长凝胶效果更好；

5）当等电聚焦电泳时间很长时候（>3000V·h），由于载体两性电解质不稳定造成的阴极漂移将成为严重问题，阴极漂移会破坏pH梯度，尤其是pH8以上的梯度，为了克服此问题，开发了一种较短时间（1600V·h）完成等电聚焦电泳的技术，即非平衡pH梯度电泳，这样可以在高pH范围内聚焦蛋白质，但该方法不能用来测定蛋白质等电点。

6）尿素可以促进蛋白质溶解，并消除蛋白质－蛋白质及蛋白质－脂类相互作用，可增加聚焦速度和提高分辨率，同时抑制阴极漂移，但是也要注意变性蛋白质的等电点可能同天然蛋白有所差异。

7）若蛋白溶液中含有SDS，可加入尿素至终浓度8M，在高浓度的尿素下，SDS同蛋白质的相互作用极小。

8）在变性液中加入2%Triton X－100以保证蛋白质（尤其是膜蛋白）的充分溶解，有些作者推荐使用如CHAPS和Zwittergent3－14等两性离子去垢剂；

9）超薄凝胶（50-500um）比常用标准等电聚焦更有优势，因为高电场强度和更佳的冷却效果使聚焦速度更快，分辨率更高。

10）在聚丙烯酰胺等电聚焦凝胶中，高分子量蛋白质（>750kd）常常表现异常的迁移行为，琼脂糖凝胶或琼脂糖－丙稀酰胺凝胶较适用于高分子量蛋白质。

11）考马斯亮蓝染色中，三氯乙酸固定后用0.25％SDS的乙醇：醋酸：水（33：10：57）溶液洗涤凝胶10-30min可以进一步改善染色效果。SDS同载体两性电解质结合后可以更好的去除载体两性电解质。

10.固相pH梯度等电聚焦电泳

简介：固相pH梯度等电聚焦是80年代建立起来的一种等电聚焦技术，其所用的介质是一些具有弱酸或弱碱性质的丙稀酰胺衍生物，它们于丙稀酰胺和甲叉双丙稀酰胺有相似的聚合行为。固定化电解质一端的双键可以在聚合中共价结合到聚丙烯酰胺介质中，其另一端的R集团为弱酸或弱碱，可在聚合物中形成弱酸或弱碱的缓冲体系，利用缓冲体系滴定终点附近一段pH范围就可行成近似线性的pH梯度，所以固相pH梯度与载体两性电解质pH梯度的区别在于前者的分子不是两性分子，在凝胶聚合时候便形成pH梯度，不随环境电场条件的改变而改变，后者是两性分子，在电场中迁移到自己的等电点后才形成pH梯度。固相pH梯度等电聚焦比传统等电聚焦具有更高的分辨率，更大的上样量，其分辨率可达到0.001pH，是目前分辨率高的电泳方法之一。

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蛋白等电聚焦凝胶电泳技术（四）

周锦帆