DNA快速检验全球研究进展（二）
2.2 快速扩增检验
一种常用的快速扩增研究方法是选用合适的快速酶并结合快速循环程序对现有的常规试剂盒进一步优化，以达到缩短PCR扩增时间为目的。如2008年Vallone等[13]将PyroStart和SpeedSTAR两种酶结合使用，PyroStart酶（Fermentas，Glen Burnie，MD）可实现快速扩增，SpeedSTAR酶（Takara Bio USA，Madison，WI）可提高腺苷酸化，优化各位点间的峰平衡，同时结合快速循环程序将Identifiler®扩增时间缩短为36 min；Amanda Foster[14]选择SpeedSTARTMHS DNA聚合酶，使用Bio-Rad C1000TM扩增仪进一步提高升降温循环的速率，同时修正每步的热循环参数，并采用两步代替3步的PCR方法使AmpFLSTR® Identifiler®整个扩增的时间为26 min；Bahlmann等[15]通过将PowerPlex®S5试剂与分别与3种可替代酶相结合研究，并同时使用快速循环程序将PCR的扩增缩短为1 h；James White[16]通过使用快速启动酶Speed STARTMHS Polymerase，结合Veriti®（Applied Biosystems，Foster City，CA，USA）rapid thermal cycler的快速循环程序，将PowerPlex® 16 HS扩增时间缩短为1 h。另一种研究方法是将常规试剂盒与快速试剂盒相结合，或是将两种或多种快速试剂联合应用。如王鸿迪等[17]联合运用AmpFLSTR Sinofile试剂盒，QIAGENFast Cycling PCR试剂盒将扩增时间缩短至60 min以内。刘琳等[18]在2013年将AmpFLSTR®Identifiler®分别与4种不同的快速PCR检测试剂——TaKaRa，Fermentas，Invitrogen，Thermo联合应用初次构建快速PCR扩增检验，并于2014年将AmpFLSTR®Identifiler Plus试剂盒与TaKaRa快速PCR检测试剂联合使用，从而将常规的扩增时间175 min缩短为为55 min，并再次验证了将TyperTM19试剂盒与快速试剂结合可有效缩短PCR扩增时间。
由此可见，多种方法和途径可以将常规PCR的扩增时间（3~5 h）不同程度的缩短，所以可以使用国产试剂结合多种商品化的试剂盒中的酶或国产的酶结合多种商品化的试剂，或是采用多种高保真、强抗抑制力的酶与多种抑制能力更强的缓冲液（均从已上市的多种试剂盒中可以获得）相互结合，多次比较，通过微调扩增体系各成分的比例、浓度，控制添加剂、抑制剂等措施来实现不同程度的快速扩增。
3 快速设备
实现法医DNA快速检验设备主要包括快速扩增设备，快速电泳分析设备。
3.1 快速扩增设备
不同扩增设备的性能，效率明显不同。Phillip Belgrader[19]最初在1998年报道使用了比9700扩增仪具有更快升降温速率和更好温控性能的微型装置充电型热循环仪器MATCI，可在21 min内完成PCR扩增。Amanda Foster[14]在建立快速PCR的方法时，将SpeedSTARTMHS DNA聚合酶分别与Bio-Rad C1000TM，Eppendorf Mastercycler®，Finnzymes Piko®扩增仪器联合使用，最终选用Bio-RadC1000TM扩增仪提高升降温循环的速率，使AmpFLSTR®Identifiler®整个时间为26 min。所以尽可能选用升降温速率快，温控性能好的快速PCR，如Bio-Rad C1000TM，Eriti扩增仪（美国AB公司），LifePro扩增仪（杭州博日科技有限公司）等可以进一步有效缩短检测时间。
3.2 快速电泳分析设备
目前国内实验室普遍配置的快速电泳检测设备有3130XL型遗传分析仪，可在45 min完成16个样本的同时检测，3730型或3730XL型遗传分析仪一次可同时完成48或96个样本检测，新型的3500XL型遗传分析仪可在30 min内完成24个样本的同时检测，但是这些检测设备仍然滞后于当前大批量生物物证检验和当代法庭科学的需求。对快速电泳分析方面的研究，2011年平原等[20]用6+1 STR试剂盒结合一种新型毛细管电泳凝胶EX-Q20进行快速电泳分析，与SinofilerTM试剂盒结合POP4胶进行比较，6+1 STR试剂盒结合新型毛细管电泳凝胶能够得到全部分型结果且耗时较短。在快速电泳部，该新型毛细管电泳凝胶EX-Q20合成丙烯酰胺-N，N-二甲丙基烯酰胺，形成一种新型准互穿聚合物网络，解决了传统毛细管电泳凝胶不能兼顾分离效果与自涂敷功能的难题，同时通过局部改良和电泳参数的设置可节约成本。
4 微流控芯片技术4.1 微流控芯片技术在法医DNA领域的发展现状
微流控芯片技术又称微全分析系统（miniaturized total analytical system，μTAS），是把生物、化学、医学分析过程的样品制备、反应、分离、检测等基本操作单元集成到一块微米尺度的芯片上，自动完成分析全过程。由于它在生物、化学、医学等领域的巨大潜力，已经发展成为一个生物、化学、医学、流体、电子、材料、机械等学科交叉的崭新研究领域。近年来诸多学者基于微流控芯片技术的角度，对涉及快速检验芯片DNA提取、芯片PCR扩增、毛细管芯片电泳及集成式芯片均进行了深入的研究。
在芯片DNA提取技术方面，国内研究最多的是以二氧化硅微球为载体的固相提取，它是M48磁珠法和硅珠法提取DNA的微型化。原理如下：以二氧化硅微球、磁性微球等介质作为DNA的固相载体，首先采用高离子盐液进行DNA吸附、有机溶剂洗脱，最后使用低离子缓冲液洗脱DNA。如2010年Duarte[21]报道了基于固相萃取原理的玻璃材质DNA提取芯片，如图 1所示，腔室的大小1.5 cm×1.4 mm×200 μm，以确保预提取的DNA溶液量恒定；在磁场作用下整个腔室充满磁性微球和盐酸胍（GuHCl），整个装置完成DNA的提取和纯化。Cady等[22]也报道了基于固相萃取原理的DNA提取芯片，硅珠、sol-gel等固相载体填充于芯片中，实现了血样等的DNA提纯。陈兴等[23]验证了在多孔氧化硅芯片和普通芯片上进行DNA提取实验，多孔氧化硅芯片提取DNA的效率更高。目前各种聚合物基底如聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）、聚碳酸酯（PC）等由于价格低廉、加工方便已经被成功用于DNA提取系统。如2007年刘惯超等[24]制作的塑料基（PMMA）的DNA提取芯片表明:经过溶胶涂渍、在内表面制作二氧化硅层的芯片能够实现从血液中提取DNA。王聿佶等[25]采用PDMS（聚二甲基硅氧烷）芯片，能对生物样品中的DNA进行有效快速提取，并且在30 min内完成PCR产物的提纯。国外还有报道基于pH诱导的静电吸附DNA提取，基于UV活化的聚碳酸酯表面的DNA提取[26]，基于纳米多孔过滤膜的DNA提取[27]。
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| 图 1 以磁珠为载体的微流体芯片动态提取DNA装置[21] |
图选项 |
芯片PCR扩增与普通PCR扩增仪相比，扩增速度有明显优势。普通台式PCR扩增仪的产物扩增管升降温度总是远远滞后于扩增仪腔本身的温度，而芯片PCR则具有明显优势。Heidi Giese[28]报导对比普通台式PCR仪器和微流控芯片使用SpeedSTAR试剂对样本进行扩增，图 2为显示的结果，普通台式PCR仪器扩增所用时间为145.1 min，芯片PCR的扩增所用时间为19.6 min，远远快于普通台式PCR仪器。采用升降温速率性能佳的PCR扩增仪可以明显缩短PCR的扩增时间，同样，提高芯片温度控制是实现芯片PCR快速扩增的关键，代表性的研究有Hagan等[29]以非接触的红外加热方式进行热循环扩增，结合SpeedSTARTDNA聚合酶，仅在45 min内完成就完成了16个STR位点在微芯片上的扩增。Mathies小组[30]则以接触式温度控制方式实现芯片上PCR的快速扩增，同时证明了芯片PCR-CE的可行性。此外微机电技术和温度传感器等方面的研究也证明了可以缩短芯片PCR扩增时间。
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| 图 2 普通台式PCR仪器与芯片PCR的扩增对比[28] |
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