TRIzol法同时提取RNA、DNA、蛋白质（二）
DNA的分离
准备试剂：乙醇0.1M柠檬酸钠（含10%乙醇）、 75%乙醇、8mM NaOH
操作步骤：
1. 样品加氯仿分层后，移去上层水相，用乙醇沉淀中间层和有机相中的DNA。每使用1mlTRIzol加0.3ml无水乙醇混匀，室温放置3分钟，2～8℃不超过2000×g离心5分钟。
2. 移去上清，（如需分离蛋白质，可保留，进一步操作见后）用含10%乙醇的0.1M柠檬酸钠洗涤DNA沉淀。每用1mlTRIzol加入1ml柠檬酸钠，室温放置30分钟，2～8℃2000×g离心5分钟，弃上清，重复一次。可以再重复一次。
3. 用75%乙醇再洗一遍DNA沉淀，每用1ml TRIzol加入1.5～2 ml75%乙醇，室温放置10～20分钟（不时颠倒混合）2～8℃2000×g离心5分钟， 弃上清。
4. 室温放置晾干DNA 5～15分钟，用8mM NaOH溶解DNA。从50～70mg组织或107细胞中分离的DNA溶于300～600μl 8mM NaOH，DNA的浓度通常为0.2～0.3μg/μl。提取的DNA沉淀不易溶于水和Tris缓冲液中，建议用弱碱溶解，8mMNaOH的pH值为9，溶解DNA后可用TE，HEPES调节pH。从某些样品（尤其是组织）中提取的DNA中可能包含一些胶状不溶物可>12000×g离心10分钟除去。
DNA的定量：取一份溶于8mMNaOH的DNA加水测A260值。一单位A260值相当于50μg/ml双链DNA。根据DNA产量可估计细胞数，人、大鼠、小鼠、1×106二倍体细胞含DNA的量分别为7.1μg，6.5μg，5.8μg。
预期产量：1mg组织或1×106细胞提取DNA分别为肝和肾3～4μg 骨骼肌，脑组织，胎盘2～3μg 人，大鼠，小鼠培养细胞（1×106）5～7μg 成纤维细胞5～7μg。
应用：
1.用于PCR 溶于8mM NaOH的DNA用0.1M HEPES调pH至8.4，取0.1～1μg DNA用作模板。
2.酶切反应用HEPES或1mM EDTA调节pH至适当值。每μg DNA使用3～5单位的酶，80～90%的DNA是可消化的。
1ml 8mM NaOH溶解的DNA样品pH值调节
Final pH 0.1M HEPES（μl） Final pH 1M HEPES（μl）
8.4 86 7.2 23
8.2 93 7.0 32
8.0 101
7.8 117
7.5 159
注意事项：
1. DNA在中间层和有机相中时可在2～8℃保存过夜。
2.DNA沉淀在75%乙醇中2～8℃可保存几个月。
3.DNA在8mM NaOH溶液中4℃可放置过夜，如长期保存需用HEPES调节pH至7～8并且加EDTA至1mM，可置于4℃或-20℃长期保存。
常见问题分析：
得率低：
A.样品匀浆和裂解的不彻底。
B.最终得到的DNA沉淀没有完全溶解。
A260/A280<1.70 ：
A. 检测吸光度时，RNA样品没有溶于水，而溶于了TE中。
B.酚除去的不彻底，可用0.1M柠檬酸钠（含10%乙醇）再洗一遍DNA沉淀。
DNA降解：
A.组织取出后没有马上处理或冷冻。
B.待提取RNA的样品没有保存于-60至-70℃，而保存在了-5至-20℃。
C.样品匀浆时使用了高速匀浆仪。
RNA污染：
A.氯仿分层后水相去除的不干净。
B.DNA沉淀用0.1M柠檬酸钠（含10%乙醇）洗的不彻底。
蛋白质的提取
准备试剂：异丙醇、含0.3M盐酸胍的95%乙醇、无水乙醇、1%SDS。
操作步骤：
1.取沉淀DNA后剩余的上清，用异丙醇沉淀蛋白质。每使用1ml TRIzol加1.5ml异丙醇，室温放置10分钟，2～8℃12000×g离心10分钟弃上清。
2.用含0.3M盐酸胍的95%乙醇洗涤蛋白质沉淀。每使用1mlTRIzol加2ml洗涤液，室温放置20分钟，2～8℃7500×g离心5分钟，弃上清，重复两次。用2ml无水乙醇同样方法再洗一次。
3.真空抽干蛋白质沉淀5～10分钟，用1%SDS溶解蛋白质，反复吸打，50℃温浴使其完全溶解，不溶物2～8℃10000×g离心10分钟除去。分离得到的蛋白质样品可用于Western Blot或-5至-20℃保存备用。
注意事项：
1.蛋白质沉淀可保存在含0.3M盐酸胍的95%乙醇或无水乙醇中2～8℃一个月以上或-5至-20℃一年以上。
2.用0.1% SDS在2～8℃透析三次，10000×g离心10分钟取上清即可用于Western Blot。
常见问题分析：
得率低：
A.样品裂解或匀浆处理不彻底。
B.最后得到的蛋白质沉淀未完全溶解。
蛋白质降解：组织取出后没有马上处理或冷冻。
电泳时条带变形：蛋白质沉淀洗涤不充分。
操作步骤：
1． 用Trizol试剂匀浆细胞和组织的方法同RNA提取步骤。
2． 在细胞匀浆中加入氯仿，每1ml Trizol的起始用量加入0.2ml氯仿。剧烈震荡30秒钟后室温放置2~3分钟。
3． 4℃下10,000g离心10分钟。
4． 小心吸取并丢弃上层水相（该水相中富含细胞总RNA，如果需要提取RNA，则收集该水相）。
5． 在剩下的中间层及有机相中加入无水乙醇，每1ml 起始Trizol用量加入0.3ml无水乙醇。颠倒充分混匀后室温放置2~3分钟。
6． 4℃下2,000g离心5分钟。
7． 小心吸取并收集上层的酚醇有机相（沉淀为DNA），转移到一个新的离心管中，加入异丙醇，每1ml 起始Trizol用量加入1.5ml异丙醇。轻轻混匀后室温放置10分钟。
8． 4℃下12,000g离心10分钟。
9． 丢弃上层液相，沉淀即为蛋白质。用清洗液（盐酸胍溶于95%乙醇中，终浓度为0.3M）清洗沉淀3次。每1ml 起始Trizol用量加入2ml清洗液清洗。在每次清洗过程中，先将沉淀保留于清洗液中20分钟（室温下），然后在4℃下7,500g离心5分钟。最后一次清洗后，丢弃上层液相，将沉淀悬浮于2ml乙醇中，涡旋震荡15秒后在室温下放置20分钟，然后在4℃下7,500g离心5分钟。
10. 丢弃上层液相，将沉淀真空干燥5~10分钟。然后将沉淀溶解于1% SDS（十二烷基硫酸钠）中。可于50℃水浴中用tip头反复吹打以助溶。不溶物在4℃下10,000g离心10分钟去除。收集上清，转移到新的收集管中。该上清中的蛋白样品可直接用于Western Blotting实验或保存于-20℃。
附注：
1. 蛋白沉淀保存于清洗液（盐酸胍溶于95%乙醇中，终浓度为0.3M）中，或保存于乙醇中，在4℃下可保存至少一个月，在-20℃下可至少保存一年。
2. 在上述步骤7中收集的酚醇有机相，可用0.1% SDS透析三次，透析后4℃下10,000g离心10分钟。上清液可直接用于Western Blotting实验。如果采用这种实验方案，可提高蛋白的回收效率。
3. 如果蛋白溶液中的SDS浓度高于0.1%，则不宜采用考马斯亮兰染色法（Bradford）法对蛋白定量。因为蛋白溶液中可能含有痕量酚，也不宜采用紫外分光光度法定量蛋白质。采用上述方法提取的蛋白，可以用lowry法或BCA法进行蛋白定量。
