离子交换层析实验（四）
六、实例: 复杂蛋白质混合物的分离
采用离子交换层析分离复合蛋白质混合物的一个典型例子就是从乳清中分离蛋白质。它可以进行一定程度的工业化放大，但也可作为一个廉价的检测体系用于离子交换剂的评价。实际上, 我们也已经通过这种蛋白质混合物来比较不同供应商所提供的离子交换剂的吸附能力（Hahnetal.，1998)。
1.牛奶的预处理
将牛奶在室温下，以 4420 g 离心 30 min 进行去脂处理。再采用 5mol/LHCl 将脱脂牛奶的 pH 调节至 4.7。酪蛋白沉淀发生之后，将溶液进一步搅拌 30 min，以期沉淀彻底。再在 17700 条件下离心 30 min。得到乳清后，再以蒸馏水进行稀释，直至溶液的电导率达到 2.7mS/cm。若稀释过程使溶液的 pH 发生变化，应再按照上述方法调节 pH 至 4.7。最后，将所得乳清溶液以 0.45 的 Millipak-60 滤器 (Millipore,Bedford,MA，USA) 过滤处理, 用于下一步的层析分离操作。
2.层析条件
将阳离子交换树脂装填 HR10 柱和 HR16 柱 (GEHealthcare，Uppsala，Sweden)。
柱直径分别为
30 mm/10 mm 和 35 mm/16 mm(高度/内径)。层析用缓冲液为柠檬酸体系，用 I.0mol/LNaOH 调节 pH。以
Imol/LNaCl、20 mmol/L 梓檬酸再生，以 pH4.7、电导率为 2.7mS/cm 的 20 mmol/L
梓樣酸平衡。平衡缓冲液冲洗掉未结合的蛋白质后，用 NaCl 浓度持续增大的连续梯度洗脱结合蛋白质。
七、实例: 采用整体柱进行高分辨率的分离
一个令人印象深刻的高分辨率分离的例子是，用阴离子交换剂整体柱（PodgornikandPodgomik,2004) 分离猛过氧化物酶 (manganeseperoxidase，MP)。该分离过程在 3 min 内即可完成。
1.Mn 过氧化物酶的制备
在装有 100 mL 氮源限制性培养基的 500 mL 锥形瓶中摇瓶培养黄孢原毛平革菌 (Phanerochaetechrysosporium)MZKIB-223(ATCC24725)(SJSftMS32 〇 C0 养基中含有 1mmol/LMn2+, 仅利于合成 MnP。培养 4 天后, 即当 MnP 的活力最高时, 收集 250 mL Rc/ir；y?? 扣菌液。随后，过滤菌液，冻存过夜后融化，离心去除其中存在的黏性多糖类物质。
2.层析条件
采用含0.34：mL
CIMQA(quaternaryamine)disk(BIASeparations，Ljubljana,Slovenia) 的 CIMdisk
整体柱分离 MnP 同工酶。以配备两个泵的梯度 HPLC 系统进行实验，其中进样阀为 100/uL 不锈钢上样环, 将具有
10_光程的可变波长监视器设置为 280nm 或 409mn, 流量 10 uL, 通过 0.25 mm 的 I.D.PEEK
毛细管进行连接。用不同浓度 (10 mmol/L 到 Imol/L) 和不同 PH(4~6) 的乙酸钠进行线性梯度洗脱分离同工酶, 流速 4
mL/min(图 22.9)。
这种快速的纯化方法可以在 2 min 内完成对亚型及两种其他类型突变体的分离。该方法还适用于蛋白质的制备和分析。
