动物实验基本技术-4
三、实验动物的准备
本文主要叙述制备转基因鼠的实验程序。
(一)不育雄性公鼠:结扎公鼠与母鼠交配以后产生假孕母鼠。受结扎的公鼠需8周以上，对种系无特殊要求。在正式实验前，结扎公鼠需与性成熟的雌性小鼠交配，反复交配两次或三次，经检查雌体有阴道栓，但均不怀孕产仔，则证明结扎成功。结扎公鼠使母鼠产生阴道栓的能力可维持2年。值得注意的是，如结扎公鼠与母鼠交配4～6
次均不能产生阴道栓，则该公鼠必须更换。
(二)假孕雌性母鼠:作为获得外源基因即转基因胚胎的养母，要求6周龄至5
个月较合适，对种系无特殊要求。其生殖系统的生理状态应与移进胚胎的发育阶段同步化，从而为移植胚胎提供着床和继续发育的生理条件。将选好的成年健康雌性个体与不育雄性个体进行交配，时间应与供体(取受精卵的雌体)同时进行。一般为下午4点钟合笼,次日晨选有阴道栓的待用。
(三)取受精卵的雌性母鼠：如果无特殊遗传背景的要求，一般用杂交F1受精卵较为理想。因杂交F1代胚胎的发育能力和对外环境的耐受能力都较强，有益于提高移植胚胎的出生率。在对遗传背景有特殊要求的情况下，供卵母鼠需选择种系，例如把一种鼠的等位基因转移到另一种不同等位基因的种系，这种卵供体母鼠必须有特定的遗传背景，因此需用纯系鼠。在实际操作中，一般用4～6周母鼠作为超排卵供体，3～4周母鼠产卵更多但卵细胞膜脆性较大，在处理过程中易破裂，而6周以后母鼠产卵逐渐减少。
(四)与卵供体母鼠交配的正常公鼠：公鼠性成熟约在6～8周，不同种系有些区别。每个作超排卵的母鼠与一只公鼠交配，次日上午检查是否有阴道栓并作记录。如两次以上都不能使母鼠有阴道栓，或总的阴道栓产生率低于60～80％，则需更换公鼠。
四、基因导入的方法
(一)显微注射法：在显微镜下，可借助显微操作仪，将毛细玻璃管直接插入受精卵的雄原核中(较大的原核),注入特定的外源基因,即为基因显微注射法。下面把利用显微注射法制备转基因鼠的方法和步骤简述如下。
1. 超数排卵(超排)与取卵
(1)超数排卵：在雌性动物发情周期的某一阶段,用促性腺激素促使卵巢里大量卵泡成熟并排出，称超数排卵。影响母鼠超排因素有母鼠的性成熟程度、营养、体重及母鼠种系。超排的最佳时间随种系不同而异,一般在3～5周，超过6周超排卵数明显减少。
在实际操作中常取4～6周龄的母鼠作超排卵供体，腹腔注射孕马血清(PMS)
和人绒毛膜促性腺激素(hCG)诱导母鼠排卵。PMS模拟卵泡刺激素(FSH)作用，hCG模拟黄体生成素(LH)的作用。二者注射时间间隔为42～48h，排卵发生在注射hCG后10～13h,注射剂量为每鼠5～10u。为了实验方便，常在下午注射PMS，隔日同一时间注射hCG，注射hCG
后每只母鼠置于一个单独饲养的正常公鼠笼内，次日晨检查阴道栓。
(2)取卵：用颈椎脱臼法处死有阴道栓的雌鼠，把完整的输卵管带一小段子宫剪下,置于PBS平衡盐溶液中，在解剖镜下找出输卵管伞部，用带4号针头的注射器将受精卵冲出，立即将卵子换至新鲜培养液内洗涤3～4次即可用于显微注射。
2.
注射外源DNA：显微注射需用显微操作仪，用来控制显微持卵针和显微注射针。持卵针是显微注射时固定受精卵的细玻璃管，管口平滑，通过一注射器控制持卵针，使其吸住要进行注射的受精卵。用来注射外源DNA的细注射针管表面平滑，尖端锋利,便于注射时穿过透明带、细胞膜等。取已制备好的受精卵细胞和外源DNA悬液,在倒置显微镜下做显微注射。注射时先用持卵针吸住受精卵，再用注射针吸取外源DNA悬液,然后推动注射针，使其刺入受精卵的雄原核，将DNA注入。注射完毕，慢慢抽出注射针,将受精卵放入新的培养液中，使其恢复。一般50～80％的受精卵在显微注射后仍保持健康。
3.
注射后受精卵(或胚胎)的移植：注射后单细胞至桑椹胚的卵(受精后0.5天到3.5天)移植至受孕后的0.5天的假孕鼠的输卵管，输卵管移植需用被透明带包裹的卵。也可将注射有外源DNA的受精卵或桑椹胚体外培养至囊胚，再行移植。显微注射后3.5天的囊胚移植至受孕后2.5天的假孕鼠子宫，子宫移植不需要有透明带。
此法的优点是，在一定设备和经验条件下，实验过程大为简化；任何DNA 顺序都可直接导入原核内,导入的外源DNA在卵裂前与受体基因组整合,其缺点在于导入的外源DNA通常以多拷贝串联的形式随机地整合于受体基因组中，妨碍其表达的正常调节。
(二)逆转录病毒感染法：以逆转录病毒作载体，
把重组的逆转录病毒载体DNA包装成高滴度病毒颗粒，感染发育早期的胚胎，将外源基因导入宿主的染色体内的方法称为逆转录病毒感染法。此法操作简单，可通过注射将重组病毒转移到囊胚腔内，也可将去透明带的胚胎与分泌重组病毒颗粒的细胞共培养，以达到将外源DNA
转移到胚胎中去的目的。
这一方法的优点是，重组逆转录病毒可同时感染大量胚胎。感染后的整合率高；外源DNA在受体细胞基因组中的整合通常是单拷贝的；不需要昂贵的显微注射设备。本法的缺点是，由于选用的受体是早期胚胎，不是受精卵，致使外源DNA
在动物各种组织中的分布不均,不易整合到生殖细胞中；由于病毒衣壳大小有限,限制了被导入的外源 DNA的大小，一般不超过15Kb。
(三)胚胎干细胞介导法：囊胚的内细胞团含有未分化的胚胎干细胞。体外建株的胚胎干细胞称为EK细胞(embryonic karyotype
cell)或(embryonic stem cell)。
如果将EK细胞移植到正常发育的囊胚腔中，它们能很快地与受体的内细胞团聚集在一起，参与正常的胚胎发育。用重组的逆转录病毒作为载体感染EK 细胞，
再将此EK细胞移植入受体囊胚腔，可发育成携带着特定外源DNA的个体。
采用这一方法的优点是，外源DNA的整合率高； 整合在生殖细胞中的比例也很高。缺点是，EK细胞株不易建立，长期培养后出现细胞分化现象；生产的转基因动物都是嵌合体。
(四)精子载体法 将外源DNA与精子一起孵育，精子可捕获外源DNA，并通过受精过程将外源DNA导入受精卵。此法不仅可免去复杂而昂贵的设备， 且可省去不少繁杂的操作和条件准备。但该法有些结果不能重复。
此外，还有一些其它的方法，都有不同的优缺点。
五、转基因鼠的检测
待假孕母鼠产出幼仔后,可用幼鼠尾巴提取DNA;对于一些基因调控研究,需要尽快获得信息而暂不需保留转基因鼠，从胎鼠组织或幼鼠尾巴提取的DNA,可用PCR、Dot blot
(斑点杂交)、Southern blot(Southern转移)等多种方法分析以确定是否转基因鼠。
六、基因转移后的存在方式及表达
(一)外源基因导入后的存在方式：外源基因被导入受体细胞后，在受体细胞内的存在方式有三种：
1. 非同源重组。大多数外源基因导入受体细胞后,与受体细胞染色体的某一位点随机整合，这样可带来正常基因的插入、缺失、易位等突变。
2. 同源重组。导入的外源DNA与受体细胞染色体的DNA 通过顺序取代或顺序插入实现同源重组。通过同源重组有可能导致受体细胞正常的基因发生突变，当然，也有可能代替原来的有遗传缺陷的遗传基因，从而纠正遗传缺陷。
3. 游离存在。外源基因没有整合到受体细胞中,而是以附加体的形式游离在受体细胞内，能自我复制，并能100％的传给下一代。
(二)外源基因导入后的表达：外源基因导入受体细胞后能否表达，是受许多因素影响的。
1. 外源基因本身的结构和性质。
2. 附带的原核载体顺序。研究发现，原核载体的存在对α-甲胎蛋白、β- 珠蛋白等基因的表达具有明显的抑制作用，而对免疫球蛋白和胶原蛋白基因的抑制不明显。
3. 染色体位置。 外源基因在受体动物细胞染色体上整合部位的基因环境对外源基因表达的影响很大。
4. 甲基化。被转移的基因容易甲基化而失活。
外源基因在受体细胞中的表达方式表现为组织特异性和发育阶段特异性。组织特异性表达是由于某些调节元件如启动子和增强子的作用造成的。比如，免疫球蛋白基因只在B细胞中表达，原因是免疫球蛋白基因的启动子只存在于B淋巴细胞内，这是一类只在专一细胞中表达的启动子；另有一类可在多种组织细胞中表达的启动子，比如，人生长激素基因分别在肝与肾、淋巴器官和肌肉中表达。发育阶段特异性表达是指转基因在个体发育中的表达具有严格的时空特性，受到精细的调控。
