免疫组化实验原理和步骤（二）
免疫组化问题解答
1、染色过强
a 抗体浓度过高戒孵育时间过长 。降低抗体滴度、抗体孵育时间：室温1小时、或4度过夜
b 孵育温度过高超过37度。 一般在室温20-28度 c DAB显色时间过长戒浓度过高 显色时间不超过5-12分钟，以显微镜下观察为准。
2、非特异性背景染色
a 操作过程中冲洗不充分 ：每步冲洗3次每次5分钟。
b 组织中含过氧化物酶未阻断：可再配置新鲜3%H2O2封闭孵育时间延长。
c 组织中含内原性生物素：正常非免疫动物血清再封闭。
d 血清蛋白封闭不充分：延长血清蛋白封闭时间。
3、染色弱
a 抗体浓度过低、孵育时间过短：提高抗体浓度、孵育时间不能少于60分钟。
b 试剂超过有效使用时间：应更换试剂。
c 操作中添加试剂时缓冲液未沥干：每步滴加试剂前沥干切片中多余的缓冲液使试剂稀释（应防止切片干燥）。
d 室温太低：低于15度，要改放在37度孵育箱孵育30-60分钟，或4度冰箱过夜。
e蛋白封闭过度：封闭不要超过12分钟。
4、染色阴性
a 操作步骤错误：应重试、设阳性对照。
b 组织中无抗原：设阳性对照以验证试验结果。
c 一抗不二抗种属连接错误：仔细确定一抗二抗种属无误。
免疫组化操作要点及技巧
1、固定：最好用4%的多聚甲醛固定液。对于冰冻切片，甲醛固定有时比冰冻丙酮好；但对于不同的组织和抗原，可选用不同的固定液。 有时候商品化的抗体会有比较适合而推荐的固定液，请于购置前注意说明书。
Bouin S固定液：饱和苦味酸750ml，甲醛250ml，冰醋酸50ml，其对组织的穿透力较强，固定较好，结构完整，但因偏酸，对抗原有一定损害，且组织收缩明显，不适于组织标本的长期保存。
PLP液：即高碘酸钠-赖氨酸-多聚甲醛，适于固定石蜡切片。适于富含糖类组织，对超微结构及许多抗原的抗原性保存较好。
2、组织脱水，透明：时间不能太长，否则在切片时容易碎片，切不完整。
3、切片时展片：有些组织在切片后难以在水中展开，这时可适当地在水中加入几滴乙醇。
4、烤片：60℃ 30分钟戒37℃ 过夜，温度太高或时间太长，抗原容易丢失。
5、蜡块及切片的保存：最好在4℃保存 。
6、脱片问题：
Poly-L-Lysine(多聚赖氨酸)为目前免疫组化染色工作中最常用的一种防脱片剂，6ml的多聚赖氨酸溶液可按1:10稀释成60ml的工作液，适合于需要酶消化、微波、高温高压的防脱片处理。如不行，可用双重处理（APES和Poly-L-Lysine）的切片。在以上两种条件都行不通的情况下，可用如下方法：切片在脱蜡前，放在APES 1：50 丙酮溶液中浸泡3分钟，晾干，即可进行下一步。
7、灭活内源性酶：HRP系统：3%双氧水灭活；AP系统：3%HAc灭活。
8、暴露抗原：对于石蜡切片的免疫组化实验时，必须采用高温加热抗原修复，这将有助于暴露抗原决定簇，从而增加免疫组化染色的强度(不同抗体的最佳修复液请参阅抗体说明书)。对不同组织，不同抗原，不同的抗体，所采用的方法应不一样，可进行热修复、胰酶消化、既不修复也不消化。胶原还可以用胃蛋白酶消化等。
9、封闭：在山羊血清封闭，非特异性染色仍然较强时，可延长封闭时或用浓缩血清封闭
10、抗体稀释：应遵循“现用现配”的原则，对亍PBS稀释的抗体一定要当天使用。
11、背景高：在抗体浓度、反应时间、反应温度等合适的条件下，如果背景依旧高，可采用含1‰ Tween20的PBS洗，特别是在显色前要多洗。
12、返蓝：在苏木素复染后，可用碱性缓冲液（如PBS）戒Na2HPO4的饱和溶液返蓝。
13、显色：一定要在显微镜下观察，注意控制背景。
14、在整个操作过程中，切片千万不能干燥，否则会有非特异性染色。
15、拍照
1)更换样品时，除了调整焦距和规野外，显微镜上的其他部件都不能动！所有样品必须一次拍摄完全。特别是在拍摄过程中，不要一会用高倍镜，一会用低倍镜，来回切换物镜。
2)数码相机必须设置为手动曝光，并且保持每张照片用同样的曝光条件，同样的曝光时间，同样的光圈。特别要注意的是，一定要将数码相机的自动白平衡功能给关掉 。
3)免疫组化切片一般染色不太深，因此拍摄出的照片颜色较浅，就让它浅。拍摄出的照片中空白部位应尽可能呈现纯白色。测量其灰度应在250左右。如果呈现淡蓝色，一般是相机自动白平衡在起作用。另外一个因素是显微镜灯光电压不正确。要使灯光本身的色温正确。既不偏黄，也不偏蓝。
