高架十字迷宫、明暗箱、旷场实验相关：高盐饮食对更年...
高架十字迷宫、明暗箱、旷场实验相关-高盐饮食对更年期焦虑小鼠海马表达的影响
高盐饮食对更年期焦虑小鼠海马钾离子 - 氯离子共转运体 2、钠 - 钾 - 氯离子失转运体 1 表达的影响
【摘 要】目的 研究高盐饮食对更年期焦虑症小鼠钾离子-氯离子共转运体 2( KCC2) 、钠-钾-氯离子共转运体 1( NKCC1) 表达的影响。方法 将大鼠随机分为空白组、模型组、4% 高盐饮食组、8% 高盐饮食组。其中 4% 高盐饮食组、8% 高盐饮食组经高盐饮食干预 1个月后，HE 染色观察脑部结构，免疫组织化学观察 KCC2、NKCC1 表达情况。结果 高盐饮食使更年期焦虑小鼠海马区锥体细胞排列紊乱，神经元数目明显减少，细胞轮廓模糊，出现大量的空泡现象，细胞形态不规则，细胞间隙明显增大; 模型组 KCC2 表达的阳性细胞明显减少，高盐饮食组阳性细胞极少; 模型组 NKCC1表达阳性细胞明显增多，高盐饮食组阳性细胞增多更明显。结论 高盐饮食加重更年期焦虑症的发生可能与 KCC2 及 NKCC1 之间的动态平衡被打破有关。
〔关键词〕 高盐饮食; 更年期焦虑症; 钾离子-氯离子共转运体 2; 钠-钾-氯离子共转运体 1
更年期焦虑症不仅影响患者的健康、社会关系、家庭生活等方面，还可引起其他精神障碍疾病，甚至产生自杀行为，且直接关系到老年期疾病的发生。因此其防治研究是临床医护人员乃至整个社会所面临的重要任务。随着年龄增长，人们味觉功能下降，在日常生活中表现为食物咸味重，研究表明我国人均吃盐及人均每天食盐摄入量均超标。本研究探讨高盐饮食对更年期焦虑小鼠钾离子-氯离子共转运体 2( KCC2) 、钠-钾-氯离子共转运体 1( NKCC1) 的影响。
1 材料与方法
1. 1 实验动物 选用 11 月龄的昆明雌性小鼠，清洁级，体重35 ～ 45 g，由长沙市开福区东创实验动物科技服务部代购，动物合格证号: scxk( 湘) 2009-0012。饲料均来自于由长沙市开福区东创实验动物科技服务部。
1. 2 试剂与仪器 羊抗鼠 KCC2、NKCC1 多克隆抗体购自美国Sigma公司。低温大容量高速离心机( 型号: KDC-2046 低温大容量离心机，中国科学技术大学科技实业有限公司) ; 电子天平( 型号: ES-C-600 电子天平，湘仪天平仪器有限公司) 。
1. 3 分组 连续 5 d 进行小鼠阴道涂片检查，呈现不规则动情周期的小鼠为自然更年期小鼠。将 40 只更年期小鼠随机分为空白组、模型组、4% 高盐饮食组、8% 高盐饮食组。分组后空白组和模型组小鼠继续给予普通饲料，4% 高盐饮食组小鼠予含 4% 的 Na Cl 高盐颗粒饲料，8% 高盐饮食组小鼠予含 8% 的Na Cl 高盐颗粒饲料喂养，自由摄食，自由饮用自来水，连续 1个月。
1. 4 实验仪器 ①高架十字迷宫模型②明暗箱③旷场实验均由上海欣软信息科技有限公司提供。
1. 5 HE 染色 实验第 31 天取材，麻醉灌注取脑，4% 多聚甲醛固定，石蜡包埋，常规 HE 染色，脱水透明封固，制成切片，光学显微镜观察。
1. 6 免疫组织化学 实验第 31 天取材，麻醉灌注取脑，4% 多聚甲醛固定，经脱水、透明、包埋，选择海马部位冠状位连续冷冻切片。以 SABC 法 进 行 免 疫 组 织 化 学: 加 入 0. 3% H2O210 min，3% 正常山羊血清封闭 10 min; 滴加一抗( 1 ∶ 100) ，过夜( 阴性对照组以正常羊血清替代一抗) ，加入羊抗兔 Ig G、SABC，室温放置 2 h，PBS 冲洗铺片，DAB 显色剂显色，脱水，封片。每只大鼠取 3 张切片，每张切片选取 3 个无重叠在显微镜( ×400) 下观察海马区 NKCC1、KCC2 的表达情况。
1. 7 统计学方法 组间比较行 t 检验。
2 结 果
2. 1 高盐饮食对更年期焦虑症小鼠脑部结构的影响
空白组海马区细胞排列整齐，细胞核圆而大，核仁清晰可见，锥体细胞排列整齐，层次紧密; 模型组海马区锥体细胞排列较紊乱，神经元数目减少，细胞轮廓较清晰，出现空泡现象，细胞形态不规则，细胞间隙相对增大; 高盐饮食组海马区锥体细胞排列紊乱，神经元数目明显减少，细胞轮廓模糊，出现大量的空泡现象，细胞形态不规则，细胞间隙明显增大，8% 高盐饮食组表现比 4%高盐饮食组更明显。
2. 2 高盐饮食对更年期焦虑症小鼠脑海马 KCC2 表达的影响
在高倍光学显微镜下，观察细胞阳性着色情况，与空白组比较，模型组 KCC2 表达阳性细胞明显减少，高盐饮食组阳性细胞极少，且 4% 和 8% 高盐组之间没有明显的差异。
2. 3 高盐饮食对更年期焦虑症小鼠脑海马 NKCC1 表达的影响
在高倍光学显微镜下，观察视野范围内细胞阳性着色情况，与空白组比较，模型组 NKCC1 表达阳性细胞明显增多，高盐饮食组阳性细胞增多更明显，但 4% 和 8% 高盐组之间没有明显的差异。
讨 论
合理的饮食结构是现代中医护理中饮食护理的中心内容之一。目前提倡合理的饮食结构，虽根据每个人的机体状况而有所不同，但总体而言首先应避免偏嗜。早古代医家就已强调饮食不宜过咸，应少吃盐。现代文献也报道食物与人的情绪有关，如多食咸味、甘味，使盐、糖摄入过多，情绪容易激动。澳大利亚学者曾历时 10 年的跟踪调查结果显示，饮食结构与抑郁、焦虑等精神紊乱之间存在密切的关系。KCC2 分布于神经元细胞膜上的转运蛋白，是神经元细胞内氯离子外排的主要因素，使 Cl－由细胞内移向细胞外，降低胞内的 Cl－浓度; NKCC1 分布于上皮细胞和非上皮细胞膜上，则顺着内向 Na 梯度促使 Cl－由细胞外移向细胞内，促进细胞内Cl－堆积，故 Cl－排出系统( KCC2) 及 Cl－聚集系统( NKCC1) 之间的动态平衡决定中枢神经系统中〔Cl－〕i。γ-氨基丁酸( GA-BA) 产生兴奋性和抑制性作用之间的进行转化的关键因素在神经元细胞 内 Cl－浓 度 差，而 功 能 相 反 的 氯 离 子 共 转 运 体KCC2 / NKCC1 是中枢神经系统内调节 Cl－浓度差、调控 GABA效应转化的关键因素。研究表明，KCC2 基因敲除的大鼠，其脑内 GABA 的抑制作用下降。NKCC1 mＲNA 表达增高及KCC2mＲNA 表达降低的变化可能引起神经元细胞内 Cl－浓度增高，Cl－梯度的崩溃，Cl－内流减少，细胞膜超级化减弱，从而导致 GABA 能抑制作用的减弱，神经元高兴奋性，使癫痫易感性增加。课题研究前期采用 EPM、高架十字迷宫成功制备焦虑症模型，且高盐饮食可加重动物焦虑程度，减少其活动次数，本研究结果显示高盐饮食加重更年期焦虑症的发生可能与高盐饮食使细胞内外的 Na+、Cl－水平发生改变，KCC2 及NKCC1 之间的动态平衡被打破，但具体机制有待进一步研究。
