电转仪助力CRISPR编辑iPSC新进展:首次报告协同基...（一）
电转仪助力CRISPR编辑iPSC新进展:首次报告协同基因编辑效应
2006年，日本科学家山中伸弥（Shinya Yamanaka）教授利用逆转录病毒将4个转录因子转入成体细胞，将其转变为诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells, iPSC)。从此后，诱导多潜能干细胞研究领域取得了极大进步，被用于研究人类疾病，目前已经有多项研究进入到临床实验阶段。CRISPR/Cas9基因编辑系统已成为目前最常使用的基因编辑工具，在基因组中生成靶向DNA双链断裂（Double strand breaks, DSBs），再通过内源性细胞DNA DSB修复途径进行修复。将CRISPR技术与iPSC技术结合，将模拟疾病发生的突变引入iPSC，或修复iPSC疾病模型中的突变, 再分化得到所需要的特定细胞进行研究或疾病治疗，是目前iPSC研究和转化领域的热点。
目前，基于CRISPR/Cas9技术在靶向区域形成DNA双链断裂(DSB)，利用非同源末端连接(Non-Homologous End Joining , NHEJ)方法导致插入和缺失突变，而微同源性末端连接(Microhomology-Mediated end Joining, MMEJ)则导致可预测缺失。NHEJ和MMEJ统称为诱变末端连接（Mutagenic End Joining，MutEJ），两种修复结果均可导致DNA序列的丢失或增加。与定制修复模板如供体质粒或单链供体寡核苷酸（Single-stranded donor oligonucleotide，ssODN）结合，利用同源定向修复（Homology-directed repair, HDR）途径可实现单核苷酸改变。然而基因精确敲入效率低下和适用性有限，需要采用定制ssODN模板进行优化HDR编辑效率。
HDR方式是复杂而精确的，需要同源序列模板，只能发生在细胞G2/S期。NHEJ方式是快速非精确的，过程中可能会随机的引入和去除几个碱基，整个细胞周期都有活跃发生的。有多种策略来提高HDR率，如单独控制DNA修复，细胞周期进程或核酸酶试剂和同源修复模板可用性，但迄今尚无明确证据表明这些策略的协同效应。
日本京都大学iPS细胞研究所的科学家最新研究表明（Nature Communications，2020），DNA DSB修复与细胞周期之间有协同作用，有利于ssOND介导的单核苷酸基因编辑。在iPS细胞中建立了基于GFP到BFP转化的荧光DNA修复测定方法，可视化定量单等位基因和双等位基因靶向过程中DNA修复结果的频率。研究发现，通过特定培养条件和小分子调节DNA修复和细胞周期，可协同增强同源性定向修复（HDR）的频率。但是，高频HDR编辑主要导致双等位基因报告基因系统中纯合突变体的产生，为了在这些条件下生产杂合突变体，这个团队采用了使用混合ssODN修复模板的策略，来保护具有沉默突变的一个等位基因。在内源性常染色体位点应用此协同基因编辑策略，与基线HDR水平相比，精确编辑生成的杂合和纯合突变提高了几倍。
考虑到基因编辑的iPS细胞在细胞治疗中应用，采用符合GMP标准的Maxcyte电转仪测试设定的实验条件，比较正常培养，冷休克，冷休克和N+S条件下DNA修复结果频率，在两种不同供体遗传背景下产生杂合和纯合GFP iPS细胞系。利用Maxcyte电转技术，在冷休克条件下，结合XL413和N+S处理，在杂合GFP iPS细胞的单等位基因编辑过程中，同源性定向修复（HDR）结果达到83.3%，在纯合GFP iPS细胞的双等位基因编辑中，HDR结果达到了96.6%。此外，当采用混合ssODN M和B修复模板编辑纯合GFP iPS细胞时，获得了32.2%的复合杂合子。实验人员由此得出，协同基因编辑导致所有目标基因座上HDR频率提高了几倍，证实了该策略在靶向人类基因组方面的广泛适用性。
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