电转仪助力CRISPR编辑iPSC新进展:首次报告协同基...（三）
研究人员发现，NHEJ抑制剂NU7441和SCR7分别提高了iPS细胞中HDR效率，联合使用时，进一步提高了HDR效率。DNA-PKcs在DSB形成后被特异性激活，并募集NHEJ途径的蛋白组分，包括可连接DNA末端的DNA连接酶IV。作者怀疑利用NU7441抑制DNA-PKcs可能会绕过NHEJ复杂的装配，并允许选择其他替代DNA修复途径，而对于下游利用SCR7抑制DNA连接酶IV，细胞可能已经致力于利用NHEJ或其他替代MutEJ修复。这可能解释，与SCR7处理相比，NU7441具有更高的HDR效率。研究人员第一次报告细胞周期同步和DNA修复途径调节对精确基因编辑有协同影响。
使用本研究的方法，在不同电转平台间，协同基因编辑作用结果相似的。在纯合GFP iPS细胞的双等位基因编辑中，与NEPA Gene电转仪HDR 48.9%比，Maxcyte具有更高的效率，HDR结果达到了96.6%, 编辑效率高了2倍。与以前报道一致，通过精确地单等位基因编辑形成的单个HDR等位基因主要与第二等位基因中插入缺失配对。因此，采用混合ssODN策略来创建可防止Cas9再裂解的复合杂合突变等位基因，当采用混合ssODN M和B修复模板编辑纯合GFP iPS细胞时，Maxcyte获得的复合杂合子比NEPA Gene高了2.9倍（32.2% vs 11.2%）。考虑到基因模型的内源性靶标，在多个基因座上实验产生纯合和复合杂合突变，结果证明协同基因编辑始终将HDR结果频率提高到基线HDR水平的几倍。
总之，研究人员建立了一个双等位基因报告系统，该系统能够解决特定的等位基因DNA修复结果，并定义了协同基因编辑条件，可使用冷休克，细胞周期同步和DNA修复调节来提高HDR和HDR/MutEJ比率。利用高效的双等位基因修饰方式，展示了产生复合杂合iPS细胞系的策略。根据研究结果可预测，提高双等位基因编辑结果的可靠性将极大地促进显性和隐性遗传疾病模型的产生，结合符合GMP标准的转染技术，甚至可能促进使用人iPSC细胞疗法的临床开发。
参考文献：
Thomas L. Maurissen & Knut Woltjen. Synergistic gene editing in human iPS cells via cell cycle and DNA repair modulation. Nature Communications. 08 June 2020
https://www.nature.com/articles/s41467-020-16643-5#Abs1
Author：Department of Life Science Frontiers, Center for iPS Cell Research and Application (CiRA), Kyoto University, Kyoto, 606-8507, Japan
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